Análise de microbioma de biofilme dentário em membranas de politetrafluoroetileno de alta densidade usadas na preservação de alvéolos (MADBioS)

Este estudo foi organizado como um ensaio clínico randomizado controlado, recrutando pacientes de uma população geral de consultórios de cirurgia oral. Os participantes são indicados para extração de pelo menos um dente e posterior colocação de implante devido à falha das terapias convencionais em preservar os dentes afetados. Antes de entrar no estudo, todos os participantes devem fornecer consentimento informado após revisar os detalhes do estudo.

Dos 56 participantes inicialmente selecionados, 39 preencheram os critérios de inclusão e foram alocados aleatoriamente em um dos dois grupos de estudo por meio de uma ferramenta de randomização baseada na web (https://www.randomizer.org/). Em ambos os grupos, um procedimento de enxerto de alvéolo será realizado imediatamente após a extração dentária, utilizando um enxerto ósseo composto composto por 50% de osso autógeno e 50% de xenoenxerto bovino (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Alemanha), após os participantes serem designados aleatoriamente. aos seguintes grupos:

• M1: No grupo M1, o local enxertado foi coberto com membrana d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Alemanha) e
• M2: No grupo M2 o local enxertado foi coberto com membrana alternativa de d-PTFE (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, EUA).

Nenhum grupo controle sem intervenção foi incluído neste estudo, pois pesquisas anteriores demonstraram que a ausência de preservação do alvéolo leva a uma perda de volume significativamente maior em comparação com quando técnicas de preservação são aplicadas.

Após extração dentária e curetagem, será avaliada a integridade da parede óssea vestibular. Em seguida, a base e a porção central do alvéolo serão preenchidas com osso autólogo, enquanto a porção superior restante (até o nível da parede bucal) será preenchida com uma mistura 50:50 de biomaterial ósseo bovino e osso autólogo. Uma membrana d-PTFE será posicionada abaixo dos retalhos de tecido mole vestibular e lingual, cobrindo 3-5 mm da parede óssea superior. A porção central da membrana permanecerá exposta, sem tentativa de fechamento primário da ferida.

Esta abordagem permite uma cobertura de membrana personalizada com base no grau de preservação da parede bucal, otimizando o suporte para a regeneração óssea. Antes da cirurgia, todos os participantes receberam remoção mecânica de placa e cálculo e foram instruídos sobre práticas de higiene bucal. Um antibiótico oral Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Croácia, ou Clindamicina MIP 600 mg, Chem. Farmacêutico. Fabrik GmbH, Ingbert, Alemanha, para pacientes alérgicos à penicilina, será administrado uma hora antes da cirurgia. Além disso, os pacientes foram enxaguados com solução de digluconato de clorexidina a 0,2% (Parodontax 0,2%, Brentford, Londres, Reino Unido) no pré-operatório.

2.4. Protocolo cirúrgico e extração de membrana Após avaliação pré-operatória, foi administrada anestesia local cloridrato de articaína 4% com adrenalina na concentração de 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Alemanha) em duas regiões: a área indicada para extração dentária e a região retromolar. região no mesmo quadrante da mandíbula, selecionada para colheita de osso autógeno. Após a extração atraumática do dente, o alvéolo foi completamente desbridado e a integridade das paredes ósseas foi avaliada com uma sonda periodontal (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, EUA). Após uma incisão intrasulcular ao redor da superfície vestibular dos dentes adjacentes, um retalho mucoperiosteal de espessura total foi elevado usando uma cureta cirúrgica (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Alemanha). Após uma avaliação completa das paredes ósseas vestibulares e da quantidade necessária de autoenxerto, um retalho de espessura total foi elevado na área doadora e o osso autógeno foi colhido usando o raspador ósseo Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Suíça) . A área doadora foi posteriormente fechada com intenção primária usando técnicas de sutura padrão.

A enxertia foi feita com a mistura de xenoenxerto bovino (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Alemanha) e autoenxerto. Com base na atribuição do grupo, uma membrana d-PTFE foi usada para cobrir o alvéolo de extração - permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Alemanha) para o grupo M1 ou Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, EUA) para o grupo M2. O retalho foi reposicionado e fixado com pontos reabsorvíveis monofilamentares 6.0 (SMI, St. Vith, Bélgica, Surgicryl Rapid 6.0), deixando a parte central da membrana intencionalmente exposta.

Quatro semanas após a extração, a membrana d-PTFE foi removida em ambos os grupos, deixando o pseudoperiósteo que cobre a parte crestal do alvéolo de extração exposto para apoiar a cicatrização. A membrana foi então preparada para posterior análise laboratorial e a cicatrização progrediu durante seis meses, após os quais foi realizada a colocação do implante no local preparado.

Para avaliar a aderência bacteriana nas membranas de d-PTFE, as amostras foram preparadas para análise SEM imediatamente após a remoção da membrana após 4 semanas de cicatrização. Após incubação em suspensões bacterianas durante 4 horas, as membranas foram enxaguadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril e depois secas ao ar numa câmara estéril de alto fluxo. As membranas foram então fixadas a 4°C com uma solução contendo 4% de glutaraldeído e 0,5% de paraformaldeído (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, EUA) em PBS 0,1 M (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, EUA). ). Após a fixação, as amostras foram submetidas a um processo gradual de desidratação por imersão em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) para preparação para a imagem. Cada membrana foi então montada em um porta-amostra usando fita de carbono condutora. Para melhorar a condutividade superficial e evitar o carregamento de elétrons sob as condições de alto vácuo do feixe de elétrons, uma fina camada de ouro-paládio de 15 nm foi aplicada usando o sistema de gravação e revestimento de precisão (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Califórnia, EUA ). Finalmente, a imagem SEM foi conduzida com um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tóquio, Japão), usando uma tensão de aceleração de 7 kV e uma distância de trabalho de 10 mm. Esta abordagem permitiu a visualização em alta resolução da morfologia do biofilme e da distribuição bacteriana nas superfícies da membrana.

Extração de ácidos nucleicos de DNA O DNA foi isolado de amostras coletadas de membranas sonicadas usando o kit Nucleospin Tissue (Macherey Nagel, Duren, Alemanha) seguindo um protocolo bacteriano modificado. Amostras sonicadas em tubos Eppendorf de 1,5 ml foram centrifugadas a 15.000 rpm por 15 minutos, após os quais o sobrenadante foi removido, deixando aproximadamente 50 μl de sedimento. Este sedimento foi ressuspenso em 250 μl de um tampão de lise G + preparado, conforme especificado pelo protocolo bacteriano modificado do fabricante, e agitado em vórtice completamente. Em seguida, foram adicionados 40 μl de solução de lisozima recém-preparada e a amostra foi incubada a 37°C por 1 hora. Em seguida, foram adicionados 30 μl de proteinase K e a amostra foi incubada a 56°C por 2 horas. Após a incubação, foram adicionados 400 μl de tampão B3, a amostra foi agitada em vórtex e depois incubada novamente a 70°C por 15 minutos. O DNA foi precipitado pela adição de 400 μl de etanol 98% resfriado. O protocolo do fabricante foi retomado para as etapas subsequentes, com o volume final de eluição reduzido para 50 μl de BE. A concentração e a pureza do DNA genômico extraído foram avaliadas usando um fluorômetro Qubit.

Análise quantitativa de PCR em tempo real (qPCR) A quantificação de bactérias nas amostras sonicadas de membrana foi realizada usando RT-PCR em um sistema de PCR rápido em tempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA), com ensaios TaqMan específicos (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA) visando espécies bacterianas chave. Esses ensaios incluíram bactérias de importância cariogênica, como os anaeróbios facultativos gram-positivos Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus, conhecidos por sua contribuição de alto risco para o desenvolvimento de cáries, e Streptococcus salivarius, que atua como antagonista dessas espécies. Além disso, os anaeróbios gram-negativos Veillonella parvula e Aggregatibacter actinomycetemcomitans foram analisados ​​para explorar as interações e associações do biofilme com a progressão da infecção gengival e periodontal. Um ensaio TaqMan específico para o gene 16s rRNA foi utilizado para representar a carga bacteriana total na placa dentária. Os iniciadores e sondas do ensaio TaqMan foram projetados para atingir especificamente os genes de cada bactéria. Para quantificação bacteriana total, a região conservada do gene 16s rRNA foi selecionada como referência.

A mistura de reação RT-PCR (20 µL) consistia em 10 µL de TaqMan Master Mix, 1 µL de ensaios TaqMan personalizados individuais para cada bactéria selecionada, 4 µL de água e 5 µL de amostra de DNA diluída a 0,5 ng/µL. Cada ensaio TaqMan continha primers específicos personalizados para amplificar os genes gtfB, gtfT, tnpA, lktA e rpoB, bem como o gene 16s rRNA como controle de referência. Além disso, cada ensaio incluiu uma sonda TaqMan marcada com fluorescência personalizada com corante AM (amidite de fluoresceína) e um Q (supressor). As condições de PCR no 7500 Fast Real-Time PCR System foram as seguintes: uma incubação inicial a 95°C por 10 minutos para ativação da Taq DNA polimerase, seguida por 50 ciclos de 95°C por 15 segundos (desnaturação do DNA) e 60°C. C por 1 minuto (ligação e extensão do primer). As reações foram realizadas em placas de 96 poços com triplicatas para cada bactéria, juntamente com controles não-modelo para todos os genes.

A detecção e quantificação dos genes amplificados para cada espécie bacteriana e o rRNA total de 16s foram baseadas em alterações no sinal de fluorescência das sondas TaqMan. A fluorescência foi emitida após hibridação e hidrólise da sonda no local alvo do ácido nucleico, pelo que um aumento na intensidade da fluorescência indicou o nível de amplificação do gene. Os resultados foram medidos utilizando um valor de ciclo limite (Ct), que representa o nível de fluorescência necessário para a detecção e é consistentemente definido dentro da fase de amplificação exponencial. À medida que DNA suficiente do gene alvo é amplificado, o sinal fluorescente é detectado, com o valor Ct indicando o ciclo em que ocorreu a detecção. Um valor de Ct mais elevado corresponde a uma concentração inicial mais baixa do gene alvo na amostra, enquanto um valor de Ct mais baixo indica uma concentração inicial mais elevada.

A quantificação relativa de cada população bacteriana foi calculada usando ΔCt, representando a diferença entre o valor Ct para o grupo bacteriano alvo e o valor Ct para a carga bacteriana total (equivalente a 16s rRNA).

NGS Para fins de sequenciamento de amplicon das regiões variáveis ​​3 e 4 do gene 16S rRNA, o DNA foi isolado das amostras de membranas 20 M1 e 16 M2 e enviado ao Laboratório de Pesquisa Molecular (MRDNA) no Texas, EUA. O sequenciamento do amplicon utilizou um conjunto de primers 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') e 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Os dados de sequenciamento foram baixados do "BaseSpace Sequence Hub da Illumina" na forma de arquivos fastq desmultiplexados e emparelhados. O processamento dos dados foi realizado utilizando o pacote de software Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). O processamento incluiu filtragem e remoção de ruído utilizando o programa DADA2, concatenação de sequências (já que foi utilizado sequenciamento de pares), bem como o controle da presença de possíveis quimeras. Para a determinação taxonômica dos microrganismos foi aplicada a ferramenta classificadora Naive Bayes no QIIME2, adaptada para trabalhar com a base de dados SILVA, versão 138. As sequências foram agrupadas segundo o critério de 99% de similaridade.

A diversidade e riqueza de todas as amostras foram estimadas pela diversidade alfa (índice de Shannon) e diversidade beta (dissimilaridade de Bray-Curtis) usando as bibliotecas seaborn, matplotlib, pandas e matplotlib da linguagem de programação Python, versão 3.12, dentro do ambiente Pycharm.