Hammaslääketieteellisen biofilmin mikrobiomianalyysi korkeatiheyksisille polytetrafluorieteenikalvoille, joita käytetään hylsyjen säilönnässä (MADBioS)

Tämä tutkimus järjestettiin satunnaistetuksi kontrolloiduksi kliiniseksi tutkimukseksi, johon rekrytoitiin potilaita suukirurgiatoimiston yleisestä väestöstä. Osallistuja on tarkoitettu vähintään yhteen hampaan poistoon ja sitä seuraavaan implantin asettamiseen, koska perinteiset hoidot eivät pysty säilyttämään vahingoittuneita hampaita. Ennen tutkimukseen osallistumista kaikkien osallistujien on annettava tietoinen suostumus tutkittuaan tutkimuksen tiedot.

Alun perin seulotusta 56 osallistujasta 39 osallistujaa täytti osallistumiskriteerit ja heidät jaettiin satunnaisesti toiseen kahdesta tutkimusryhmästä verkkopohjaisen satunnaistustyökalun (https://www.randomizer.org/) kautta. Molemmissa ryhmissä istukkasiirre tehdään välittömästi hampaan poiston jälkeen käyttämällä yhdistettyä luusiirrettä, joka sisältää 50 % autogeenista luuta ja 50 % naudan ksenograftia (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Saksa), sen jälkeen, kun osallistujat on jaettu satunnaisesti. seuraaviin ryhmiin:

• M1: Ryhmässä M1 siirretty kohta peitettiin d-PTFE-kalvolla (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Saksa) ja
• M2: Ryhmässä M2 siirretty kohta peitettiin vaihtoehtoisella d-PTFE-kalvolla (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Tähän tutkimukseen ei sisällytetty ei-interventio-kontrolliryhmää, koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että pistorasiasäilytyksen puuttuminen johtaa merkittävästi suurempaan tilavuushäviöön verrattuna säilytystekniikoiden soveltamiseen.

Hampaan poiston ja kyretoinnin jälkeen poskiluun seinämän eheys arvioidaan. Sitten istukan pohja ja keskiosa täytetään autologisella luulla, kun taas jäljelle jäävä yläosa (bukkaaliseinän tasoon asti) täytetään 50:50 naudan luun biomateriaalin ja autologisen luun seoksella. d-PTFE-kalvo sijoitetaan posken ja linguaalisen pehmytkudosläpän alle, joka peittää 3-5 mm luun yläseinästä. Kalvon keskiosa jää näkyviin ilman, että haavaa yritetään sulkea ensisijaisesti.

Tämä lähestymistapa mahdollistaa räätälöidyn kalvopeiton, joka perustuu posken seinämän säilymisasteeseen, mikä optimoi tuen luun regeneraatiolle. Ennen leikkausta kaikki osallistujat saivat mekaanisen plakin ja hammaskiven poiston, ja heille opastettiin suuhygieniakäytäntöjä. Suun kautta otettava antibiootti Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatia, tai Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Saksa, penisilliiniallergisille potilaille, annetaan tuntia ennen leikkausta. Lisäksi potilaat huuhdeltiin 0,2-prosenttisella klooriheksidiinidiglukonaattiliuoksella (Parodontax 0,2%, Brentford, Lontoo, UK) ennen leikkausta.

2.4. Kirurginen protokolla ja kalvon poisto Leikkausta edeltävän arvioinnin jälkeen paikallispuudutuksessa 4-prosenttista artikaiinihydrokloridia ja adrenaliinia pitoisuudessa 1:200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Saksa) annettiin kahdelle alueelle: hampaanpoistoalueelle ja retromolaariselle alueelle. alueella samassa leuan kvadrantissa, valittu autogeeniseen luun keräämiseen. Hampaan atraumaattisen poiston jälkeen syvennys puhdistettiin perusteellisesti ja luun seinämien eheys arvioitiin periodontaalisella koettimella (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Viereisten hampaiden bukkaalipinnan ympärille tehdyn intrasulkulaarisen viillon jälkeen täysipaksuinen mukoperiosteaalinen läppä nostettiin käyttämällä kirurgista kyrettiä (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Saksa). Bukkaaliseinien ja tarvittavan autograftin määrän perusteellisen arvioinnin jälkeen luovutuskohdassa nostettiin täysi paksuinen läppä ja autogeeninen luu otettiin talteen Safescraper® Twist -luukaapimella (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Sveitsi). . Luovuttajakohta suljettiin myöhemmin ensisijaisella tarkoituksella käyttämällä tavallisia ompelutekniikoita.

Oksastus suoritettiin naudan ksenograftin (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Saksa) ja autograftin seoksella. Ryhmäjaon perusteella d-PTFE-kalvoa käytettiin peittämään uuttopistoke - joko permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Saksa) M1-ryhmälle tai Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) M2-ryhmälle. Läppä asetettiin uudelleen ja kiinnitettiin resorboituvilla monofilamentti 6.0 ompeleilla (SMI, St. Vith, Belgia, Surgicryl Rapid 6.0), jolloin kalvon keskiosa jätettiin tarkoituksella paljaaksi.

Neljä viikkoa uuttamisen jälkeen d-PTFE-kalvo poistettiin molemmista ryhmistä, jolloin uuttoholkin harjaosan peittävä pseudoperosteum jäi alttiiksi tuen paranemiselle. Tämän jälkeen kalvo valmistettiin laboratorioanalyysiä varten ja paranemisen annettiin edetä kuuden kuukauden ajan, minkä jälkeen implantti asetettiin valmistettuun kohtaan.

Bakteerien kiinnittymisen arvioimiseksi d-PTFE-kalvoilla näytteet valmisteltiin SEM-analyysiä varten välittömästi kalvon poistamisen jälkeen 4 viikon paranemisen jälkeen. Bakteerisuspensioissa 4 tunnin inkuboinnin jälkeen kalvot huuhdeltiin steriilissä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja sitten ilmakuivattiin korkeavirtaussteriilissä kammiossa. Kalvot kiinnitettiin sitten 4 °C:seen liuoksella, joka sisälsi 4 % glutaarialdehydiä ja 0,5 % paraformaldehydiä (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) 0,1 M PBS:ssä (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) ). Kiinnityksen jälkeen näytteille tehtiin asteittainen dehydratointiprosessi upottamalla niitä kasvaviin etanolipitoisuuksiin (50 %, 70 %, 80 %, 90 % ja 100 %) kuvantamisen valmistelemiseksi. Jokainen kalvo kiinnitettiin sitten näytepidikkeeseen käyttämällä johtavaa hiiliteippiä. Pintajohtavuuden parantamiseksi ja elektronien varaamisen estämiseksi elektronisuihkun suurissa tyhjiöolosuhteissa levitettiin ohut 15 nm kulta-palladiumkerros käyttämällä tarkkuusetsaus- ja pinnoitusjärjestelmää (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Kalifornia, USA) ). Lopuksi SEM-kuvaus suoritettiin Jeol JSM-7800F -kenttäemission pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (JEOL Ltd., Tokio, Japani), käyttämällä 7 kV:n kiihdytysjännitettä ja 10 mm:n työetäisyyttä. Tämä lähestymistapa mahdollisti biofilmin morfologian ja bakteerien jakautumisen korkearesoluutioisen visualisoinnin kalvon pinnoilla.

DNA:n nukleiinihappojen uuttaminen DNA eristettiin kerätyistä kalvosonikaattinäytteistä käyttämällä Nucleospin Tissue Kit -pakkausta (Macherey Nagel, Duren, Saksa) modifioitua bakteeriprotokollaa noudattaen. Sonikoidut näytteet 1,5 ml:n Eppendorf-putkissa sentrifugoitiin 15 000 rpm:llä 15 minuuttia, minkä jälkeen supernatantti poistettiin, jolloin jäljelle jäi noin 50 μl sedimenttiä. Tämä sedimentti suspendoitiin uudelleen 250 µl:aan valmistettua G+ -lyysipuskuria valmistajan muunnetun bakteeriprotokollan mukaisesti ja vorteksoitiin perusteellisesti. Seuraavaksi lisättiin 40 μl juuri valmistettua lysotsyymiliuosta ja näytettä inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunti. Tämän jälkeen lisättiin 30 μl proteinaasi K:ta ja näytettä inkuboitiin 56 °C:ssa 2 tuntia. Inkuboinnin jälkeen lisättiin 400 μl B3-puskuria, näytettä vorteksoitiin ja inkuboitiin sitten uudelleen 70 °C:ssa 15 minuuttia. DNA saostettiin lisäämällä 400 µl jäähdytettyä 98 % etanolia. Valmistajan protokollaa jatkettiin myöhempiä vaiheita varten, ja lopullinen eluointitilavuus pienennettiin 50 μl:aan BE:tä. Uutetun genomisen DNA:n pitoisuus ja puhtaus arvioitiin käyttämällä Qubit-fluorometriä.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) -analyysi Bakteerien kvantifiointi kalvosonikaattinäytteissä suoritettiin käyttämällä RT-PCR:ää Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR -järjestelmällä (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) erityisillä TaqMan-määrityksillä. (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA), jotka kohdistuvat tärkeimpiin bakteerilajeihin. Nämä määritykset sisälsivät kariogeenisesti merkittäviä bakteereja, kuten grampositiiviset fakultatiiviset anaerobit Streptococcus mutans ja Streptococcus sobrinus, jotka tunnetaan suuresta riskistä karieksen kehittymiseen, ja Streptococcus salivarius, joka toimii näiden lajien antagonistina. Lisäksi gramnegatiiviset anaerobit Veillonella parvula ja Aggregatibacter actinomycetemcomitans analysoitiin biofilmin vuorovaikutusten ja yhteyksien tutkimiseksi ien- ja parodontaaliinfektion etenemisen kanssa. Spesifistä TaqMan-määritystä 16s rRNA-geenille käytettiin edustamaan bakteerien kokonaismäärää hammasplakissa. TaqMan-määritysalukkeet ja -koettimet suunniteltiin kohdentamaan erityisesti kunkin bakteerin geenit. Bakteerien kokonaismäärää varten 16s-rRNA-geenin konservoitunut alue valittiin referenssiksi.

RT-PCR-reaktioseos (20 µl) koostui 10 µl:sta TaqMan Master Mixiä, 1 µl:sta yksittäisiä Custom TaqMan -määrityksiä kullekin valitulle bakteerille, 4 µl:sta vettä ja 5 µl:sta DNA-näytettä laimennettuna konsentraatioon 0,5 ng/µl. Jokainen TaqMan-määritys sisälsi spesifisiä räätälöityjä alukkeita gtfB-, gtfT-, tnpA-, lktA- ja rpoB-geenien monistamiseksi sekä 16s rRNA-geenin vertailukontrollina. Lisäksi jokainen määritys sisälsi räätälöidyn TaqMan-fluoresoivasti leimatun koettimen, jossa oli AM (fluoreseiiniamidiitti) väriaine ja Q (sammuttaja). PCR-olosuhteet 7500 Fast Real-Time PCR -järjestelmässä olivat seuraavat: ensimmäinen inkubaatio 95 °C:ssa 10 minuuttia Taq DNA-polymeraasin aktivoimiseksi, mitä seurasi 50 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan (DNA-denaturaatio) ja 60 °C:ssa. C 1 minuutin ajan (pohjusteen sitominen ja pidennys). Reaktiot suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä, joissa kullekin bakteerille oli kolme rinnakkaiskappaletta, kaikkien geenien ei-templaattikontrollien ohella.

Kunkin bakteerilajin monistettujen geenien ja 16s rRNA:n kokonaismäärän havaitseminen ja kvantifiointi perustui muutoksiin TaqMan-koettimien fluoresenssisignaalissa. Fluoresenssi emittoitui koettimen hybridisaation ja hydrolyysin yhteydessä kohdenukleiinihappokohdassa, joten fluoresenssin intensiteetin kasvu osoitti geenin monistumisen tason. Tulokset mitattiin käyttämällä kynnyssyklin (Ct) arvoa, joka edustaa havaitsemiseen tarvittavaa fluoresenssitasoa ja on johdonmukaisesti asetettu eksponentiaalisen vahvistusvaiheen sisällä. Kun riittävästi kohdegeenin DNA:ta monistetaan, fluoresoiva signaali havaitaan, ja Ct-arvo osoittaa syklin, jossa havaitseminen tapahtui. Korkeampi Ct-arvo vastaa kohdegeenin pienempää alkupitoisuutta näytteessä, kun taas pienempi Ct-arvo osoittaa suurempaa alkupitoisuutta.

Kunkin bakteeripopulaation suhteellinen kvantifiointi laskettiin käyttämällä ΔCt:tä, joka edustaa eroa kohdebakteeriryhmän Ct-arvon ja bakteerien kokonaismäärän Ct-arvon välillä (16s rRNA-ekvivalentti).

NGS 16S-rRNA-geenin vaihtelevien alueiden 3 ja 4 amplikonisekvensointia varten DNA eristettiin 20 M1- ja 16 M2-kalvonäytteistä ja lähetettiin Molecular Research Laboratorylle (MRDNA) Texasissa, USA:ssa. Amplikonin sekvensointi käytti sarjaa alukkeita 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') ja 806R (5'-GGACTACNGGGTATCTAAT-3'). Sekvensointitiedot ladattiin "Illumina's BaseSpace Sequence Hubista" pariliitospäätteisten, demultipleksoitujen fastq-tiedostojen muodossa. Tietojen käsittely suoritettiin käyttämällä ohjelmistopakettia Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Prosessointi sisälsi suodatuksen ja kohinanpoiston DADA2-ohjelmalla, sekvenssien yhdistämisen (koska käytettiin paripään sekvensointia) sekä mahdollisten kimeerien läsnäolon valvonnan. Mikro-organismien taksonomiseen määritykseen käytettiin QIIME2:n Naive Bayes -luokitustyökalua, joka on sovitettu toimimaan SILVA-tietokannan version 138 kanssa. Sekvenssit ryhmiteltiin 99 %:n samankaltaisuuden kriteerin mukaan.

Kaikkien näytteiden monimuotoisuus ja rikkaus arvioitiin alfadiversiteetillä (Shannon-indeksi) ja beta-diversiteetillä (Bray-Curtis-eroisuus) käyttäen Seaborn-, matplotlib-, pandas- ja matplotlib-kirjastoja Python-ohjelmointikielen versiolla 3.12 Pycharm-ympäristössä.