Mikrobiomanalys av dental biofilm på högdensitetspolytetrafluoretylenmembraner som används vid socketkonservering (MADBioS)

Denna studie organiserades som en randomiserad kontrollerad klinisk prövning, som rekryterar patienter från en allmän population av oralkirurgiska kontor. Deltagarna är indicerade för minst en tandutdragning och efterföljande implantatplacering på grund av att konventionella terapier misslyckats med att bevara drabbade tänder. Innan de går in i studien måste alla deltagare ge informerat samtycke efter att ha granskat studiedetaljerna.

Av 56 deltagare som först screenades uppfyllde 39 deltagare inklusionskriterierna och fördelades slumpmässigt till en av två studiegrupper via ett webbaserat randomiseringsverktyg (https://www.randomizer.org/). I båda grupperna kommer en sockettransplantationsprocedur att utföras omedelbart efter tandextraktion, med användning av ett kompositbentransplantat bestående av 50 % autogent ben och 50 % bovint xenograft (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland), efter att deltagarna slumpmässigt tilldelats till följande grupper:

• M1: I gruppen M1 täcktes det ympade stället med ett d-PTFE-membran (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) och
• M2: I gruppen M2 täcktes det ympade stället med ett alternativt d-PTFE-membran (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Ingen icke-interventionskontrollgrupp inkluderades i denna studie, eftersom tidigare forskningsstudier har visat att frånvaron av sockelkonservering leder till signifikant större volymförlust jämfört med när konserveringstekniker tillämpas.

Efter tandutdragning och curettage kommer integriteten av den buckala benväggen att bedömas. Sedan kommer basen och den centrala delen av hylsan att fyllas med autologt ben, medan den återstående övre delen (upp till nivån av den buckala väggen) kommer att fyllas med en 50:50 blandning av bovint benbiomaterial och autologt ben. Ett d-PTFE-membran kommer att placeras under de buckala och linguala mjukvävnadsflikarna, som täcker 3-5 mm av den övre benväggen. Den centrala delen av membranet kommer att förbli exponerad, utan några försök att uppnå primär sårtillslutning.

Detta tillvägagångssätt möjliggör skräddarsydd membrantäckning baserat på graden av bevarande av munväggen, vilket optimerar stödet för benregenerering. Före operationen fick alla deltagare mekanisk plack och tandstensborttagning och instruerades i munhygienpraxis. Ett oralt antibiotikum Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatien, eller Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Tyskland, för penicillinallergiska patienter, kommer att administreras en timme före operationen. Dessutom sköljde patienterna med en 0,2 % klorhexidindiglukonatlösning (Parodontax 0,2 %, Brentford, London, Storbritannien) preoperativt.

2.4. Kirurgiskt protokoll och membranextraktion Efter den preoperativa bedömningen administrerades lokalbedövning 4 % artikainhydroklorid med adrenalin i en koncentration av 1:200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Tyskland) till två regioner: området indikerat för tandextraktion och retromolar region i samma käkkvadrant, vald för autogen benskörd. Efter atraumatisk extraktion av tanden debriderades sockeln noggrant och benväggarnas integritet bedömdes med en periodontal sond (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Efter ett intrasulkulärt snitt runt den buckala ytan av de intilliggande tänderna höjdes en mucoperiosteal flik i full tjocklek med användning av en kirurgisk curette (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Tyskland). Efter en noggrann bedömning av de buckala benväggarna och den erforderliga mängden autograft, höjdes en flik i full tjocklek på donatorstället och autogent ben skördades med hjälp av Safescraper® Twist benskrapa (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Schweiz) . Donatorstället stängdes därefter med primär avsikt med användning av standardsuturtekniker.

Ympningen gjordes med blandningen av bovint xenotransplantat (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) och autograft. Baserat på grupptilldelning användes ett d-PTFE-membran för att täcka extraktionsuttaget - antingen permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) för M1-gruppen eller Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) för M2-gruppen. Fliken placerades om och säkrades med resorberbara monofilament 6.0-suturer (SMI, St. Vith, Belgien, Surgicryl Rapid 6.0), vilket lämnade den centrala delen av membranet avsiktligt exponerad.

Fyra veckor efter extraktion avlägsnades d-PTFE-membranet i båda grupperna, vilket lämnade pseudoperiosteumet som täcker den crestala delen av extraktionshålet exponerat för att stödja läkning. Membranet förbereddes sedan för ytterligare laboratorieanalys och läkningen fick fortskrida i sex månader, varefter implantatplacering utfördes på den preparerade platsen.

För att utvärdera bakteriell vidhäftning på d-PTFE-membranen förbereddes prover för SEM-analys omedelbart efter membranborttagning efter 4 veckors läkning. Efter inkubation i bakteriesuspensioner under 4 timmar sköljdes membranen i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lufttorkades sedan i en steril högflödeskammare. Membran fixerades sedan vid 4°C med en lösning innehållande 4 % glutaraldehyd och 0,5 % paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) i 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) ). Efter fixering genomgick proverna en graderad dehydreringsprocess genom nedsänkning i ökande etanolkoncentrationer (50 %, 70 %, 80 %, 90 % och 100 %) för att förbereda för avbildning. Varje membran monterades sedan på en provhållare med användning av ledande koltejp. För att förbättra ytkonduktiviteten och förhindra elektronladdning under högvakuumförhållandena i elektronstrålen applicerades ett tunt 15 nm lager av guld-palladium med användning av precisionsetsnings- och beläggningssystemet (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Kalifornien, USA) ). Slutligen utfördes SEM-avbildning med ett Jeol JSM-7800F fältemissionsskanningselektronmikroskop (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), med en accelerationsspänning på 7 kV och ett arbetsavstånd på 10 mm. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde högupplöst visualisering av biofilmmorfologi och bakteriefördelning på membranytorna.

Extraktion av DNA-nukleinsyror DNA isolerades från insamlade membransonikatprover med användning av Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Tyskland) enligt ett modifierat bakterieprotokoll. Sonikerade prover i 1,5 ml Eppendorf-rör centrifugerades vid 15 000 rpm i 15 minuter, varefter supernatanten avlägsnades och lämnade cirka 50 μl sediment. Detta sediment återsuspenderades i 250 μl av en förberedd G+-lysbuffert, enligt tillverkarens modifierade bakterieprotokoll, och vortexades noggrant. Därefter tillsattes 40 μl nyberedd lysozymlösning och provet inkuberades vid 37°C i 1 timme. Efter detta tillsattes 30 μl proteinas K och provet inkuberades vid 56°C i 2 timmar. Efter inkubation tillsattes 400 μl B3-buffert, provet vortexades och inkuberades sedan igen vid 70°C i 15 minuter. DNA fälldes ut genom att tillsätta 400 μl kyld 98% etanol. Tillverkarens protokoll återupptogs för efterföljande steg, med den slutliga elueringsvolymen reducerad till 50 μl BE. Koncentrationen och renheten av det extraherade genomiska DNA:t bedömdes med användning av en Qubit-fluorometer.

Kvantitativ realtids-PCR-analys (qPCR) Kvantifiering av bakterier i membransonicatproverna utfördes med RT-PCR på ett Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA), med specifika TaqMan-analyser (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) riktar in sig på viktiga bakteriearter. Dessa analyser inkluderade bakterier av kariogen betydelse, såsom de grampositiva fakultativa anaeroberna Streptococcus mutans och Streptococcus sobrinus, kända för sitt högriskbidrag till kariesutveckling, och Streptococcus salivarius, som fungerar som en antagonist till dessa arter. Dessutom analyserades de gramnegativa anaeroberna Veillonella parvula och Aggregatibacter actinomycetemcomitans för att utforska biofilminteraktioner och associationer med tandkötts- och parodontala infektionsprogression. En specifik TaqMan-analys för 16s rRNA-genen användes för att representera den totala bakteriebelastningen i tandplack. TaqMan-analysprimrar och prober designades för att specifikt rikta in generna för varje bakterie. För total bakteriell kvantifiering valdes den konserverade regionen av 16s rRNA-genen ut som referens.

RT-PCR-reaktionsblandningen (20 µL) bestod av 10 µL TaqMan Master Mix, 1 µL individuella Custom TaqMan-analyser för varje utvald bakterie, 4 µL vatten och 5 µL DNA-prov utspätt till 0,5 ng/µL. Varje TaqMan-analys innehöll specifika specialdesignade primers för amplifiering av gtfB-, gtfT-, tnpA-, lktA- och rpoB-generna, såväl som 16s rRNA-genen som referenskontroll. Dessutom inkluderade varje analys en specialdesignad TaqMan fluorescensmärkt sond med AM (fluoresceinamidit) färgämne och en Q (quencher). PCR-förhållandena på 7500 Fast Real-Time PCR System var följande: en initial inkubation vid 95°C i 10 minuter för Taq DNA-polymerasaktivering, följt av 50 cykler av 95°C i 15 sekunder (DNA-denaturering) och 60° C i 1 minut (primerbindning och förlängning). Reaktionerna utfördes i 96-brunnars plattor med triplikat för varje bakterie, tillsammans med icke-mallkontroller för alla gener.

Detektion och kvantifiering av de amplifierade generna för varje bakterieart och det totala 16s rRNA:t baserades på förändringar i fluorescenssignalen för TaqMan-proberna. Fluorescens emitterades vid hybridisering och hydrolys av sonden vid målnukleinsyrastället, så en ökning av fluorescensintensiteten indikerade nivån av genamplifiering. Resultaten mättes med användning av ett tröskelcykelvärde (Ct), som representerar den fluorescensnivå som behövs för detektion och är konsekvent inställd inom den exponentiella amplifieringsfasen. När tillräckligt med DNA från målgenen amplifieras detekteras den fluorescerande signalen, med Ct-värdet som indikerar cykeln i vilken detektion inträffade. Ett högre Ct-värde motsvarar en lägre initial koncentration av målgenen i provet, medan ett lägre Ct-värde indikerar en högre initial koncentration.

Relativ kvantifiering av varje bakteriepopulation beräknades med användning av ΔCt, som representerar skillnaden mellan Ct-värdet för målbakteriegruppen och Ct-värdet för den totala bakteriemängden (16s rRNA-ekvivalent).

NGS För amplikonsekvensering av variabla regioner 3 och 4 av 16S rRNA-genen, isolerades DNA från proverna av 20 M1 och 16 M2 membran och skickades till Molecular Research Laboratory (MRDNA) i Texas, USA. Amplikonsekvensering använde en uppsättning primrar 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') och 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Sekvenseringsdata laddades ner från "Illuminas BaseSpace Sequence Hub" i form av parade, demultiplexade fastq-filer. Databehandlingen utfördes med hjälp av mjukvarupaketet Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Bearbetning inkluderade filtrering och denoising med DADA2-programmet, sammanlänkning av sekvenser (eftersom par-änd-sekvensering användes), såväl som kontrollen för närvaron av möjliga chimärer. För taxonomisk bestämning av mikroorganismer användes Naive Bayes-klassificeringsverktyget i QIIME2, anpassat för att fungera med SILVA-databasen, version 138. Sekvenserna grupperades enligt kriteriet 99% likhet.

Mångfalden och rikedomen av alla prover uppskattades av alfa-diversitet (Shannon-index) och beta-diversitet (Bray-Curtis-skillnad) med användning av seaborn, matplotlib, pandas och matplotlib-biblioteken av Python-programmeringsspråket, version 3.12, inom Pycharm-miljön.