用于牙槽窝保存的高密度聚四氟乙烯膜上牙科生物膜的微生物组分析 (MADBioS)

这项研究是一项随机对照临床试验，从口腔外科办公室的一般人群中招募患者。 由于传统疗法无法保留受影响的牙齿，参与者需要至少拔除一颗牙齿并随后植入种植体。 在进入研究之前，所有参与者必须在审查研究细节后提供知情同意书。

在最初筛选的 56 名参与者中，有 39 名参与者符合纳入标准，并通过基于网络的随机化工具 (https://www.randomizer.org/) 被随机分配到两个研究组之一。 在两组中，参与者被随机分配后，将在拔牙后立即进行牙槽移植手术，使用包含 50% 自体骨和 50% 牛异种移植物的复合骨移植物（cerabone®，botiss biomaterials GmbH，Zossen，德国）给以下团体：

• M1：在 M1 组中，移植部位覆盖有 d-PTFE 膜（Permamem®，botiss biomaterials GmbH，Zossen，德国），并且
• M2：在 M2 组中，移植部位覆盖有替代的 d-PTFE 膜（Cytoplast™，Osteogenics Biomedical，德克萨斯州，美国）。

本研究中未纳入非干预对照组，因为之前的研究表明，与应用保存技术相比，缺乏牙槽窝保存会导致显着更大的体积损失。

拔牙和刮牙后，将评估颊骨壁的完整性。 然后，牙槽的底部和中央部分将填充自体骨，而剩余的上部（直至颊壁水平）将填充牛骨生物材料和自体骨的 50:50 混合物。 d-PTFE 膜将放置在颊侧和舌侧软组织瓣下方，覆盖上骨壁 3-5 毫米。 膜的中心部分将保持暴露状态，不会尝试实现初级伤口闭合。

这种方法允许根据颊壁保存的程度定制膜覆盖，优化对骨再生的支持。 手术前，所有参与者都接受了机械牙菌斑和牙石去除术，并接受了口腔卫生习惯方面的指导。 口服抗生素 Klavocin bid 1000 mg，Pliva，萨格勒布，克罗地亚，或克林霉素 MIP 600 mg，Chem。 医药。 Fabrik GmbH, Ingbert, 德国，针对青霉素过敏患者，将在手术前一小时给药。 此外，患者术前用 0.2% 氯己定二葡萄糖酸盐溶液（Parodontax 0.2%，布伦特福德，伦敦，英国）冲洗。

2.4. 手术方案和膜拔除 术前评估后，对两个区域施用浓度为 1:200,000 的 4% 盐酸阿替卡因加肾上腺素（Ubistesin Forte，3M，诺伊斯，德国）进行局部麻醉：拔牙区域和磨牙后区域位于同一颌象限的区域，选择用于自体骨采集。 无创伤拔牙后，彻底清除牙槽窝，并用牙周探针（15 UNC Color-Coded，Hu-Friedy，芝加哥，美国）评估骨壁的完整性。 在邻牙颊面周围进行龈沟内切口后，使用手术刮匙（Lucas 2.5 mm，Helmut Zepf，Seitingen-Oberflacht，德国）将全层粘骨膜瓣提起。 在对颊骨壁和所需自体移植物数量进行彻底评估后，在供体部位升高全层皮瓣，并使用 Safescraper® Twist 骨刮刀（瑞士巴塞尔 Geistlich 骨采集仪器）采集自体骨。 随后使用标准缝合技术主要目的关闭供体部位。

使用牛异种移植物（cerabone®，Botiss Biomaterials GmbH，Zossen，德国）和自体移植物的混合物进行移植。 根据分组情况，使用 d-PTFE 膜覆盖拔牙槽 - M1 组使用 permamem®（Botiss Biomaterials GmbH，Zossen，德国），M2 组使用 Cytoplast™（Osteogenics Biomedical，德克萨斯州，美国）。 将皮瓣重新定位并用可吸收单丝 6.0 缝线（SMI，圣维特，比利时，Surgicryl Rapid 6.0）固定，故意暴露膜的中心部分。

拔牙后 4 周，两组的 d-PTFE 膜均被去除，留下覆盖拔牙槽牙槽嵴部分的假骨膜，以支持愈合。 然后准备好膜以供进一步的实验室分析，并允许愈合进行六个月，然后在准备好的部位进行种植体植入。

为了评估 d-PTFE 膜上的细菌粘附情况，在愈合 4 周后去除膜后立即制备样品进行 SEM 分析。 在细菌悬浮液中孵育 4 小时后，用无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗膜，然后在高流量无菌室中风干。 然后将膜在 4°C 下用含有 4% 戊二醛和 0.5% 多聚甲醛（Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA）的 0.1 M PBS（pH 7.2）溶液（Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA）固定。 ）。 固定后，样品通过浸泡在浓度逐渐增加的乙醇（50%、70%、80%、90% 和 100%）中进行分级脱水过程，为成像做准备。 然后使用导电碳带将每个膜安装到样品架上。 为了增强表面电导率并防止电子束高真空条件下的电子充电，使用精密蚀刻和涂层系统（PECS II，Gatan Inc.，Pleasanton，California，USA）涂敷了一层薄薄的 15 nm 金钯层。 ）。 最后，使用 Jeol JSM-7800F 场发射扫描电子显微镜（JEOL Ltd.，东京，日本）进行 SEM 成像，加速电压为 7 kV，工作距离为 10 mm。 这种方法可以实现生物膜形态和膜表面细菌分布的高分辨率可视化。

DNA 核酸的提取 使用 Nucleospin 组织试剂盒（Macherey Nagel，Duren，德国）按照修改的细菌方案从收集的膜超声样品中分离 DNA。 将 1.5 ml Eppendorf 管中的超声处理样品以 15,000 rpm 离心 15 分钟，然后除去上清液，留下约 50 μl 沉淀物。 按照制造商修改的细菌方案的规定，将该沉淀物重悬于 250 μl 准备好的 G+ 裂解缓冲液中，并彻底涡旋。 接下来，加入40μl新鲜制备的溶菌酶溶液，并将样品在37℃下孵育1小时。 随后，添加30μl蛋白酶K，并将样品在56℃下孵育2小时。 孵育后，加入400μl B3缓冲液，涡旋样品，然后在70℃下再次孵育15分钟。 添加 400 μl 冷冻的 98% 乙醇沉淀 DNA。 后续步骤恢复制造商的方案，最终洗脱体积减少至 50 μl BE。 使用 Qubit 荧光计评估提取的基因组 DNA 的浓度和纯度。

定量实时 PCR (qPCR) 分析 在 Applied Biosystems 7500 快速实时 PCR 系统（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国）上使用 RT-PCR 对膜超声样品中的细菌进行定量，并进行特定的 TaqMan 分析（应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州，美国）针对关键细菌种类。 这些检测包括具有致龋意义的细菌，例如革兰氏阳性兼性厌氧菌变形链球菌和远缘链球菌（以其对龋齿发展的高风险贡献而闻名），以及唾液链球菌（作为这些物种的拮抗剂）。 此外，还分析了革兰氏阴性厌氧菌小韦荣球菌和放线聚集菌，以探索生物膜相互作用以及与牙龈和牙周感染进展的关联。 使用针对 16s rRNA 基因的特定 TaqMan 检测来代表牙菌斑中的总细菌负荷。 TaqMan 检测引物和探针专门针对每种细菌的基因而设计。 对于总细菌定量，选择 16s rRNA 基因的保守区域作为参考。

RT-PCR 反应混合物 (20 µL) 包含 10 µL TaqMan Master Mix、1 µL 针对每种选定细菌的单独定制 TaqMan 检测试剂盒、4 µL 水和 5 µL 稀释至 0.5 ng/µL 的 DNA 样品。 每个 TaqMan 检测均包含特定的定制设计引物，用于扩增 gtfB、gtfT、tnpA、lktA 和 rpoB 基因，以及作为参考对照的 16s rRNA 基因。 此外，每个测定都包括定制设计的 TaqMan 荧光标记探针，带有 AM（荧光素酰胺）染料和 Q（猝灭剂）。 7500 快速实时 PCR 系统的 PCR 条件如下：在 95°C 下初始孵育 10 分钟以激活 Taq DNA 聚合酶，然后进行 50 个循环，即 95°C 15 秒（DNA 变性）和 60°C C 1 分钟（引物结合和延伸）。 反应在 96 孔板中进行，每种细菌一式三份，所有基因均采用非模板对照。

每个细菌物种的扩增基因和总 16s rRNA 的检测和定量基于 TaqMan 探针荧光信号的变化。 探针在目标核酸位点杂交和水解时发出荧光，因此荧光强度的增加表明基因扩增的水平。 使用阈值循环 (Ct) 值测量结果，该阈值代表检测所需的荧光水平，并在指数扩增阶段内一致设置。 当足够的靶基因DNA被扩增时，荧光信号被检测到，Ct值指示检测发生的周期。 较高的 Ct 值对应于样品中靶基因的初始浓度较低，而较低的 Ct 值则表示较高的初始浓度。

使用 ΔCt 计算每个细菌群体的相对定量，ΔCt 代表目标细菌群的 Ct 值与总细菌负荷（16s rRNA 当量）的 Ct 值之间的差异。

NGS 为了对 16S rRNA 基因的可变区 3 和 4 进行扩增子测序，从 20 M1 和 16 M2 膜的样品中分离出 DNA，并将其送往美国德克萨斯州的分子研究实验室 (MRDNA)。 扩增子测序使用一组引物 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') 和 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')。 测序数据以双端、多路分离的 fastq 文件形式从“Illumina 的 BaseSpace Sequence Hub”下载。 使用软件包 Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2) 进行数据处理。 处理包括使用 DADA2 程序进行过滤和去噪、序列串联（因为使用了双端测序）以及对可能嵌合体存在的控制。 为了对微生物进行分类学测定，应用了 QIIME2 中的朴素贝叶斯分类器工具，该工具适用于 SILVA 数据库版本 138。 根据99%相似性的标准对序列进行分组。

所有样本的多样性和丰富度均在 Pycharm 环境中使用 Seaborn、matplotlib、pandas 和 matplotlib 库通过 Python 编程语言版本 3.12 的 alpha 多样性（香农指数）和 beta 多样性（Bray-Curtis 相异性）进行估计。