Analisi del microbioma del biofilm dentale su membrane di politetrafluoroetilene ad alta densità utilizzate nella conservazione dell'alveolo (MADBioS)

Questo studio è stato organizzato come uno studio clinico randomizzato e controllato, reclutando pazienti da una popolazione generale di studi di chirurgia orale. I partecipanti sono indicati per almeno un'estrazione del dente e il successivo posizionamento dell'impianto a causa del fallimento delle terapie convenzionali nel preservare i denti colpiti. Prima di entrare nello studio, tutti i partecipanti devono fornire il consenso informato dopo aver esaminato i dettagli dello studio.

Dei 56 partecipanti inizialmente selezionati, 39 partecipanti hanno soddisfatto i criteri di inclusione e sono stati assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi di studio tramite uno strumento di randomizzazione basato sul web (https://www.randomizer.org/). In entrambi i gruppi, immediatamente dopo l'estrazione del dente verrà eseguita una procedura di innesto dell'alveolo, utilizzando un innesto osseo composito comprendente il 50% di osso autologo e il 50% di xenotrapianto bovino (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Germania), dopo che i partecipanti sono stati assegnati in modo casuale ai seguenti gruppi:

• M1: Nel gruppo M1, il sito innestato è stato coperto con una membrana d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Germania) e
• M2: Nel gruppo M2 il sito innestato è stato coperto con una membrana d-PTFE alternativa (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

In questo studio non è stato incluso alcun gruppo di controllo senza intervento, poiché studi di ricerca precedenti hanno dimostrato che l'assenza di conservazione dell'alveolo porta a una perdita di volume significativamente maggiore rispetto a quando vengono applicate tecniche di conservazione.

Dopo l'estrazione del dente e il curettage, verrà valutata l'integrità della parete ossea vestibolare. Successivamente, la base e la porzione centrale dell'alveolo verranno riempite con osso autologo, mentre la restante porzione superiore (fino al livello della parete vestibolare) sarà riempita con una miscela 50:50 di biomateriale di osso bovino e osso autologo. Una membrana d-PTFE sarà posizionata sotto i lembi dei tessuti molli buccali e linguali, coprendo 3-5 mm della parete ossea superiore. La porzione centrale della membrana rimarrà esposta, senza alcun tentativo di ottenere la chiusura primaria della ferita.

Questo approccio consente una copertura della membrana su misura in base al grado di conservazione della parete buccale, ottimizzando il supporto per la rigenerazione ossea. Prima dell'intervento chirurgico, tutti i partecipanti hanno ricevuto la rimozione meccanica della placca e del tartaro e sono stati istruiti sulle pratiche di igiene orale. Un antibiotico orale Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagabria, Croazia, o Clindamicina MIP 600 mg, Chem. Farm. Fabrik GmbH, Ingbert, Germania, per i pazienti allergici alla penicillina, verrà somministrato un'ora prima dell'intervento chirurgico. Inoltre, i pazienti sono stati risciacquati con una soluzione di clorexidina digluconato allo 0,2% (Parodontax 0,2%, Brentford, Londra, Regno Unito) prima dell'intervento.

2.4. Protocollo chirurgico ed estrazione della membrana Dopo la valutazione preoperatoria, è stata somministrata un'anestesia locale con articaina cloridrato al 4% con adrenalina ad una concentrazione di 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Germania) in due regioni: l'area indicata per l'estrazione del dente e l'area retromolare regione nello stesso quadrante mascellare, selezionata per il prelievo di osso autologo. Dopo l'estrazione atraumatica del dente, l'alveolo è stato accuratamente sbrigliato e l'integrità delle pareti ossee è stata valutata con una sonda parodontale (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Dopo un'incisione intrasulculare attorno alla superficie buccale dei denti adiacenti, è stato sollevato un lembo mucoperiostale a tutto spessore utilizzando una curette chirurgica (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Germania). Dopo una valutazione approfondita delle pareti ossee buccali e della quantità necessaria di innesto autologo, è stato sollevato un lembo a tutto spessore nel sito donatore ed è stato raccolto l'osso autologo utilizzando il raschietto osseo Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basilea, Svizzera) . Il sito donatore è stato successivamente chiuso con intenzione primaria utilizzando tecniche di sutura standard.

L'innesto è stato effettuato con la miscela di xenotrapianto bovino (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Germania) e autotrapianto. In base all'assegnazione del gruppo, è stata utilizzata una membrana in d-PTFE per coprire l'alveolo estrattivo: permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Germania) per il gruppo M1 o Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) per il gruppo M2. Il lembo è stato riposizionato e fissato con suture monofilamento riassorbibili 6.0 (SMI, St. Vith, Belgio, Surgicryl Rapid 6.0), lasciando la parte centrale della membrana intenzionalmente esposta.

Quattro settimane dopo l’estrazione, la membrana in d-PTFE è stata rimossa in entrambi i gruppi, lasciando esposto lo pseudoperiostio che ricopre la parte crestale dell’alveolo estrattivo per favorire la guarigione. La membrana è stata quindi preparata per ulteriori analisi di laboratorio e la guarigione è stata lasciata progredire per sei mesi, dopodiché è stato eseguito il posizionamento dell'impianto nel sito preparato.

Per valutare l'adesione batterica sulle membrane d-PTFE, i campioni sono stati preparati per l'analisi SEM immediatamente dopo la rimozione della membrana dopo 4 settimane di guarigione. Dopo l'incubazione in sospensioni batteriche per 4 ore, le membrane sono state risciacquate in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e quindi asciugate all'aria in una camera sterile ad alto flusso. Le membrane sono state quindi fissate a 4° C con una soluzione contenente il 4% di glutaraldeide e lo 0,5% di paraformaldeide (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) in PBS 0,1 M (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA ). Dopo la fissazione, i campioni sono stati sottoposti a un processo di disidratazione graduale mediante immersione in concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per prepararsi all'imaging. Ciascuna membrana è stata quindi montata su un supporto per campioni utilizzando nastro di carbonio conduttivo. Per migliorare la conduttività superficiale e prevenire la carica degli elettroni nelle condizioni di alto vuoto del fascio di elettroni, è stato applicato un sottile strato di oro-palladio da 15 nm utilizzando il sistema di incisione e rivestimento di precisione (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, California, USA ). Infine, l'imaging SEM è stato condotto con un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokyo, Giappone), utilizzando una tensione di accelerazione di 7 kV e una distanza di lavoro di 10 mm. Questo approccio ha consentito la visualizzazione ad alta risoluzione della morfologia del biofilm e della distribuzione batterica sulle superfici della membrana.

Estrazione degli acidi nucleici del DNA Il DNA è stato isolato dai campioni raccolti con membrana sonicata utilizzando il kit Nucleospin Tissue (Macherey Nagel, Duren, Germania) seguendo un protocollo batterico modificato. I campioni sonicati in provette Eppendorf da 1,5 ml sono stati centrifugati a 15.000 giri al minuto per 15 minuti, dopodiché il surnatante è stato rimosso, lasciando circa 50 μl di sedimento. Questo sedimento è stato risospeso in 250 μl di tampone di lisi G+ preparato, come specificato dal protocollo batterico modificato del produttore, e agitato accuratamente su vortex. Successivamente sono stati aggiunti 40 μl di soluzione di lisozima appena preparata e il campione è stato incubato a 37°C per 1 ora. Successivamente sono stati aggiunti 30 μl di proteinasi K e il campione è stato incubato a 56°C per 2 ore. Dopo l'incubazione, sono stati aggiunti 400 μl di tampone B3, il campione è stato agitato su vortex e quindi nuovamente incubato a 70°C per 15 minuti. Il DNA è stato precipitato aggiungendo 400 μl di etanolo al 98% refrigerato. Il protocollo del produttore è stato ripreso per le fasi successive, con il volume di eluizione finale ridotto a 50 μl di BE. La concentrazione e la purezza del DNA genomico estratto sono state valutate utilizzando un fluorimetro Qubit.

Analisi quantitativa PCR in tempo reale (qPCR) La quantificazione dei batteri nei campioni sottoposti a sonicazione della membrana è stata eseguita utilizzando RT-PCR su un sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), con test TaqMan specifici (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) mirato a specie batteriche chiave. Questi test includevano batteri di significato cariogeno, come gli anaerobi facoltativi gram-positivi Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus, noti per il loro contributo ad alto rischio allo sviluppo della carie, e Streptococcus salivarius, che agisce come un antagonista di queste specie. Inoltre, sono stati analizzati gli anaerobi gram-negativi Veillonella parvula e Aggregatibacter actinomycetemcomitans per esplorare le interazioni e le associazioni del biofilm con la progressione dell’infezione gengivale e parodontale. Per rappresentare la carica batterica totale nella placca dentale è stato utilizzato un test TaqMan specifico per il gene rRNA 16s. I primer e le sonde del test TaqMan sono stati progettati per colpire specificamente i geni di ciascun batterio. Per la quantificazione batterica totale, è stata selezionata come riferimento la regione conservata del gene rRNA 16s.

La miscela di reazione RT-PCR (20 µL) consisteva in 10 µL di TaqMan Master Mix, 1 µL di singoli test TaqMan personalizzati per ciascun batterio selezionato, 4 µL di acqua e 5 µL di campione di DNA diluito a 0,5 ng/μL. Ciascun test TaqMan conteneva primer specifici progettati su misura per amplificare i geni gtfB, gtfT, tnpA, lktA e rpoB, nonché il gene 16s rRNA come controllo di riferimento. Inoltre, ciascun test includeva una sonda TaqMan marcata in modo fluorescente personalizzata con colorante AM (fluoresceina amidite) e un Q (quencher). Le condizioni della PCR sul sistema 7500 Fast Real-Time PCR erano le seguenti: un'incubazione iniziale a 95°C per 10 minuti per l'attivazione della Taq DNA polimerasi, seguita da 50 cicli a 95°C per 15 secondi (denaturazione del DNA) e 60° C per 1 minuto (rilegatura del primer ed estensione). Le reazioni sono state condotte in piastre da 96 pozzetti con triplicati per ciascun batterio, insieme a controlli non modello per tutti i geni.

Il rilevamento e la quantificazione dei geni amplificati per ciascuna specie batterica e dell'rRNA 16s totale si basavano sui cambiamenti nel segnale di fluorescenza delle sonde TaqMan. La fluorescenza è stata emessa durante l'ibridazione e l'idrolisi della sonda nel sito dell'acido nucleico target, quindi un aumento dell'intensità della fluorescenza indicava il livello di amplificazione genetica. I risultati sono stati misurati utilizzando un valore del ciclo soglia (Ct), che rappresenta il livello di fluorescenza necessario per il rilevamento ed è costantemente impostato all'interno della fase di amplificazione esponenziale. Quando viene amplificato una quantità sufficiente di DNA del gene bersaglio, viene rilevato il segnale fluorescente, con il valore Ct che indica il ciclo in cui si è verificato il rilevamento. Un valore Ct più alto corrisponde a una concentrazione iniziale inferiore del gene bersaglio nel campione, mentre un valore Ct più basso indica una concentrazione iniziale più alta.

La quantificazione relativa di ciascuna popolazione batterica è stata calcolata utilizzando ΔCt, che rappresenta la differenza tra il valore Ct per il gruppo batterico target e il valore Ct per la carica batterica totale (equivalente di rRNA 16s).

NGS Ai fini del sequenziamento degli ampliconi delle regioni variabili 3 e 4 del gene 16S rRNA, il DNA è stato isolato dai campioni di 20 membrane M1 e 16 M2 e inviato al Laboratorio di ricerca molecolare (MRDNA) in Texas, USA. Il sequenziamento dell'amplicone ha utilizzato un set di primer 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') e 806R (5'-GGACTACNNGGGTTATCTAAT-3'). I dati di sequenziamento sono stati scaricati da "BaseSpace Sequence Hub di Illumina" sotto forma di file fastq demultiplexati e accoppiati. L'elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando il pacchetto software Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). L'elaborazione includeva il filtraggio e la rimozione del rumore utilizzando il programma DADA2, la concatenazione di sequenze (poiché è stato utilizzato il sequenziamento di coppia), nonché il controllo della presenza di possibili chimere. Per la determinazione tassonomica dei microrganismi è stato applicato lo strumento di classificazione Naive Bayes in QIIME2, adattato per funzionare con il database SILVA, versione 138. Le sequenze sono state raggruppate secondo il criterio della somiglianza del 99%.

La diversità e la ricchezza di tutti i campioni sono state stimate dalla diversità alfa (indice di Shannon) e dalla diversità beta (dissomiglianza di Bray-Curtis) utilizzando le librerie seaborn, matplotlib, pandas e matplotlib del linguaggio di programmazione Python, versione 3.12, all'interno dell'ambiente Pycharm.