Analiza mikrobiomu biofilmu dentystycznego na membranach z politetrafluoroetylenu o dużej gęstości stosowanych w konserwacji zębodołu (MADBioS)

Badanie to zorganizowano jako randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, do którego rekrutowano pacjentów z ogólnej populacji gabinetu chirurgii jamy ustnej. Uczestnik jest wskazany do co najmniej jednej ekstrakcji zęba i późniejszego wszczepienia implantu ze względu na niepowodzenie konwencjonalnych terapii w zachowaniu zmienionych zębów. Przed przystąpieniem do badania wszyscy uczestnicy muszą wyrazić świadomą zgodę po zapoznaniu się ze szczegółami badania.

Spośród 56 uczestników wstępnie przebadanych przesiewowo, 39 spełniło kryteria włączenia i zostało losowo przydzielonych do jednej z dwóch grup badawczych za pomocą internetowego narzędzia do randomizacji (https://www.randomizer.org/). W obu grupach natychmiast po ekstrakcji zęba zostanie wykonany zabieg przeszczepienia zębodołu przy użyciu kompozytowego przeszczepu kości składającego się z 50% kości autogennej i 50% ksenoprzeszczepu bydlęcego (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Niemcy), po losowym przydzieleniu uczestników do następujących grup:

• M1: W grupie M1 miejsce przeszczepu pokryto membraną d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Niemcy) i
• M2: W grupie M2 miejsce przeszczepu pokryto alternatywną membraną d-PTFE (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Teksas, USA).

Do tego badania nie włączono żadnej grupy kontrolnej nieinterwencyjnej, ponieważ poprzednie badania wykazały, że brak konserwacji zębodołu prowadzi do znacznie większej utraty objętości w porównaniu z zastosowaniem technik konserwacji.

Po ekstrakcji zęba i łyżeczkowaniu zostanie oceniona integralność ściany kości policzkowej. Następnie podstawa i środkowa część zębodołu zostanie wypełniona kością autologiczną, natomiast pozostała część górna (do poziomu ściany policzkowej) zostanie wypełniona mieszanką biomateriału kostnego bydlęcego i kości autologicznej w proporcjach 50:50. Pod policzkowymi i językowymi płatami tkanki miękkiej zostanie umieszczona membrana d-PTFE, pokrywająca 3–5 mm górnej ściany kości. Centralna część membrany pozostanie odsłonięta, bez próby pierwotnego zamknięcia rany.

Takie podejście pozwala na indywidualne pokrycie membrany w oparciu o stopień zachowania ściany policzkowej, optymalizując wsparcie regeneracji kości. Przed zabiegiem wszyscy uczestnicy zostali poddani mechanicznemu usunięciu płytki nazębnej i kamienia nazębnego oraz zostali poinstruowani w zakresie higieny jamy ustnej. Doustny antybiotyk Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagrzeb, Chorwacja lub Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Farmacja. Fabrik GmbH, Ingbert, Niemcy, pacjentom uczulonym na penicylinę, będzie podawany na godzinę przed zabiegiem chirurgicznym. Dodatkowo przed operacją pacjentów przepłukiwano 0,2% roztworem diglukonianu chlorheksydyny (Parodontax 0,2%, Brentford, Londyn, Wielka Brytania).

2.4. Protokół zabiegu i ekstrakcja błony Po ocenie przedoperacyjnej podano znieczulenie miejscowe 4% chlorowodorkiem artykainy z adrenaliną w stężeniu 1:200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Niemcy) w dwóch obszarach: obszar wskazany do ekstrakcji zęba oraz obszar zatrzonowcowy. regionie w tym samym kwadrancie szczęki, wybranym do pobrania kości autogennej. Po atraumatycznej ekstrakcji zęba dokładnie oczyszczono zębodół i oceniono integralność ścian kości sondą periodontologiczną (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Po wykonaniu nacięcia wewnątrzzębowego wokół powierzchni policzkowej sąsiednich zębów, za pomocą łyżeczki chirurgicznej (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Niemcy) uniesiono płat śluzówkowo-okostnowy pełnej grubości. Po dokładnej ocenie ścian kości policzkowej i wymaganej ilości autoprzeszczepu, w miejscu pobrania uniesiono płat pełnej grubości i pobrano kość autogenną za pomocą skrobaka do kości Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Bazylea, Szwajcaria). . Następnie miejsce pobrania zamknięto zgodnie z pierwotnym zamiarem, stosując standardowe techniki szycia.

Przeszczepu dokonano mieszaniną ksenoprzeszczepu bydlęcego (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Niemcy) i autoprzeszczepu. W oparciu o przypisanie grupowe do zakrycia zębodołu ekstrakcyjnego zastosowano membranę d-PTFE – permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Niemcy) dla grupy M1 lub Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Teksas, USA) dla grupy M2. Płat przeniesiono i zabezpieczono resorbowalnymi szwami monofilamentowymi 6,0 (SMI, St. Vith, Belgia, Surgicryl Rapid 6,0), pozostawiając celowo odsłoniętą środkową część membrany.

Cztery tygodnie po ekstrakcji w obu grupach usunięto membranę d-PTFE, pozostawiając okostną rzekomą pokrywającą część wyrostka zębodołowego odsłoniętą w celu wspomagania gojenia. Następnie membranę przygotowano do dalszej analizy laboratoryjnej, pozostawiono do gojenia na okres sześciu miesięcy, po czym w przygotowanym miejscu wszczepiono implant.

Aby ocenić przyleganie bakterii do membran d-PTFE, próbki przygotowano do analizy SEM natychmiast po usunięciu membrany, po 4 tygodniach gojenia. Po inkubacji w zawiesinach bakteryjnych przez 4 godziny membrany przepłukano sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie wysuszono na powietrzu w sterylnej komorze o wysokim przepływie. Następnie membrany utrwalono w temperaturze 4°C roztworem zawierającym 4% aldehydu glutarowego i 0,5% paraformaldehydu (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) w 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA ). Po utrwaleniu próbki poddano stopniowanemu procesowi odwadniania poprzez zanurzenie w etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 80%, 90% i 100%) w celu przygotowania do obrazowania. Następnie każdą membranę zamontowano na uchwycie próbki za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. Aby poprawić przewodność powierzchniową i zapobiec ładowaniu elektronów w warunkach wysokiej próżni wiązki elektronów, nałożono cienką warstwę złota i palladu o grubości 15 nm przy użyciu precyzyjnego systemu trawienia i powlekania (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Kalifornia, USA ). Na koniec obrazowanie SEM przeprowadzono za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokio, Japonia), stosując napięcie przyspieszające 7 kV i odległość roboczą 10 mm. Podejście to umożliwiło wizualizację w wysokiej rozdzielczości morfologii biofilmu i rozmieszczenia bakterii na powierzchniach membran.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych DNA DNA wyizolowano z pobranych próbek sonikatu błony przy użyciu zestawu Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Niemcy) zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem bakteryjnym. Próbki poddane działaniu ultradźwięków w 1,5 ml probówkach Eppendorfa wirowano przy 15 000 obr./min przez 15 minut, po czym usunięto supernatant, pozostawiając około 50 µl osadu. Osad ten ponownie zawieszono w 250 µl przygotowanego buforu do lizy G+, jak określono w zmodyfikowanym protokole bakteryjnym producenta, i dokładnie wirowano. Następnie dodano 40 µl świeżo przygotowanego roztworu lizozymu i próbkę inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie dodano 30 µl proteinazy K i próbkę inkubowano w temperaturze 56°C przez 2 godziny. Po inkubacji dodano 400 µl buforu B3, próbkę wirowano i ponownie inkubowano w temperaturze 70°C przez 15 minut. DNA wytrącono przez dodanie 400 µl schłodzonego 98% etanolu. W kolejnych etapach kontynuowano procedurę producenta, przy czym końcową objętość elucji zmniejszono do 50 µl BE. Stężenie i czystość wyekstrahowanego genomowego DNA oceniano za pomocą fluorometru Qubit.

Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) Ilościową analizę bakterii w próbkach sonikatu membrany przeprowadzono przy użyciu RT-PCR w systemie Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA), przy użyciu specyficznych testów TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) ukierunkowane na kluczowe gatunki bakterii. Testy te obejmowały bakterie o znaczeniu próchnicotwórczym, takie jak Gram-dodatnie fakultatywne beztlenowce Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus, znane ze swojego wysokiego ryzyka udziału w rozwoju próchnicy, oraz Streptococcus salivarius, który działa jako antagonista tych gatunków. Dodatkowo przeanalizowano Gram-ujemne beztlenowce Veillonella parvula i Aggregatibacter actinomycetemcomitans w celu zbadania interakcji biofilmu i powiązań z postępem infekcji dziąseł i przyzębia. Aby określić całkowite obciążenie bakteryjne w płytce nazębnej, zastosowano specyficzny test TaqMan dla genu 16s rRNA. Startery i sondy do testu TaqMan zaprojektowano tak, aby specyficznie namierzać geny każdej bakterii. Do ilościowego oznaczenia całkowitej liczby bakterii jako odniesienie wybrano konserwatywny region genu 16s rRNA.

Mieszanina reakcyjna RT-PCR (20 µl) składała się z 10 µl TaqMan Master Mix, 1 µl indywidualnych testów TaqMan dla każdej wybranej bakterii, 4 µl wody i 5 µl próbki DNA rozcieńczonej do 0,5 ng/µl. Każdy test TaqMan zawierał specyficzne, specjalnie zaprojektowane startery do amplifikacji genów gtfB, gtfT, tnpA, lktA i rpoB, a także genu 16s rRNA jako kontrolę referencyjną. Dodatkowo każdy test zawierał specjalnie zaprojektowaną, znakowaną fluorescencyjnie sondę TaqMan z barwnikiem AM (amidyt fluoresceiny) i Q (wygaszacz). Warunki PCR w systemie 7500 Fast Real-Time PCR były następujące: początkowa inkubacja w temperaturze 95°C przez 10 minut w celu aktywacji polimerazy DNA Taq, następnie 50 cykli w temperaturze 95°C przez 15 sekund (denaturacja DNA) i w temperaturze 60° C przez 1 minutę (wiązanie i wydłużanie podkładu). Reakcje przeprowadzono w 96-studzienkowych płytkach w trzech powtórzeniach dla każdej bakterii, wraz z kontrolami bez matrycy dla wszystkich genów.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe amplifikowanych genów dla każdego gatunku bakterii oraz całkowitego 16s rRNA opierało się na zmianach w sygnale fluorescencji sond TaqMan. Fluorescencja była emitowana podczas hybrydyzacji i hydrolizy sondy w docelowym miejscu kwasu nukleinowego, więc wzrost intensywności fluorescencji wskazywał na poziom amplifikacji genu. Wyniki mierzono przy użyciu wartości cyklu progowego (Ct), która reprezentuje poziom fluorescencji potrzebny do detekcji i jest konsekwentnie ustalana w fazie wykładniczego amplifikacji. W miarę amplifikacji wystarczającej ilości DNA docelowego genu wykrywany jest sygnał fluorescencyjny, a wartość Ct wskazuje cykl, w którym nastąpiło wykrycie. Wyższa wartość Ct odpowiada niższemu początkowemu stężeniu docelowego genu w próbce, natomiast niższa wartość Ct wskazuje wyższe początkowe stężenie.

Względną ocenę ilościową każdej populacji bakterii obliczono przy użyciu ΔCt, reprezentującego różnicę między wartością Ct dla docelowej grupy bakterii a wartością Ct dla całkowitego obciążenia bakteryjnego (równoważnik 16s rRNA).

NGS W celu sekwencjonowania amplikonu regionów zmiennych 3 i 4 genu 16S rRNA, z próbek membran 20 M1 i 16 M2 wyizolowano DNA i przesłano do Laboratorium Badań Molekularnych (MRDNA) w Teksasie, USA. Do sekwencjonowania amplikonu wykorzystano zestaw starterów 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') i 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Dane sekwencjonowania pobrano z „Illumina's BaseSpace Sequence Hub” w postaci demultipleksowanych plików fastq o sparowanych końcach. Przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Przetwarzanie obejmowało filtrowanie i odszumianie przy użyciu programu DADA2, łączenie sekwencji (ponieważ zastosowano sekwencjonowanie na końcach par), a także kontrolę obecności ewentualnych chimer. Do taksonomicznego oznaczania mikroorganizmów wykorzystano narzędzie klasyfikujące Naive Bayes w QIIME2, przystosowane do współpracy z bazą SILVA wersja 138. Sekwencje pogrupowano według kryterium 99% podobieństwa.

Różnorodność i bogactwo wszystkich próbek oszacowano na podstawie różnorodności alfa (indeks Shannona) i różnorodności beta (odmienność Braya-Curtisa) przy użyciu bibliotek seaborn, matplotlib, pandas i matplotlib języka programowania Python w wersji 3.12 w środowisku Pycharm.