ドライアイにおける眼表面微生物叢の潜在的な役割：微生物相互作用と症状の緩和

研究デザインとサンプル収集この研究は、無作為化、二重盲検、および前向き試験です。 包含基準は次のとおりでした：ドライアイ症候群の症状を抱える19歳以上の患者。 合計50人の参加者が、CSAグループ（n = 25、シクロスポリンA 1日2回、1日2回ヒアルロン酸）または対照群（n = 25、毎日4回のヒアルロン酸）のいずれかにランダムに割り当てられました。 この研究では、0.05％シクロスポリンA（シポリンN点眼薬、韓国、テイジュン薬剤、テイジュンファーマ）および0.15％のヒアルロン酸（新しいヒアルニ目ドロップ、テイジュンファーマ）を使用しました。 視聴は、審査官とサンプルコレクターを分離することにより維持されました。

除外基準には、研究結果、前脳腫瘍、前脳炎、デメデックスの侵入、寄生眼感染症、浸透型眼の腫瘍の浸透症の浸透型眼の侵入、腫瘍の浸透症の侵入、腫瘍の腫瘍の存在に影響を与える可能性のある局所眼滴または全身薬（全身ステロイド、免疫調節剤、テトラサイクリンなど）の使用が含まれていました。角膜形成術、コンタクトレンズの使用、またはベースラインの3か月以内に眼科外科手術。 さらに、単一の機能的な眼、妊娠または母乳育児の女性、および避妊のない妊娠のリスクがある被験者は除外されました。

臨床データとOSサンプルは、目滴投与前のベースライン（V1）および治療開始後の4週間（V2）および12週間（V3）で収集されました（図1A）。 V1の50人の参加者のうち、各グループの21人の参加者がV2でフォローアップを完了し、CSAグループの14人の参加者とNewhyaluniグループの18人の参加者がV3に残りました。微生物叢分析のためのOSサンプルは、滅菌混合セルロースエステル（MCF）膜（Millipore、Merck）を使用して、下部結膜SACから得られました。 OSサンプルは、CSAグループの13人の参加者とNewhyaluniグループの13人の参加者から収集されました。 すべてのOSサンプルは、Microbiome分析のためにDNA抽出まで-80°Cで保存されました。

臨床データ収集の症状は、眼表面疾患指数（OSDI）、痛みのための視覚アナログスケール（VAS）、および眼の乾燥（速度）アンケートの修正された標準患者評価を使用して評価されました。 涙膜の安定性は、涙の分解時間（TBUT）を測定することにより評価されました。 角膜のフルオレセイン染色は、滅菌食塩水を滅菌フルオレセインストリップに滴ることにより行いました。 被験者が自然に3回瞬きした後、通常の瞬きから涙液フィルムのドライスポットの最初の外観の間の時間が録音されました。 分析には、3つの繰り返し測定値の平均が使用されました。

OS炎症は、オックスフォードスコアリングシステム（50）に従って等級付けされたフルオレセイン染色スコア（FSS）を使用して評価されました。 蓋腺の炎症、および蓋の縁の膨満感の重症度は、軽度、中程度、または重度として等級付けされました。 涙分の分泌は、麻酔なしのシルマーストリップを使用して測定されました。 下眼の結膜と下部の脳底結膜の間に、下まぶたの側面3分の1にシルマーストリップが配置されました。 5分後、ストリップによって吸収される涙液の長さをミリメートルで測定しました。

DNA抽出とメタゲノム全体のシーケンス総DNAは、RNEASY PowerMicrobiome Kit（Qiagen、Inc.、Valencia、CA、USA）を使用して、収集されたOSサンプルから抽出されました。 DNA濃度は、μCuvetteG1.0（Eppendorf、ハンブルク、ドイツ）を使用して、生体恐怖計D30で測定しました。 実験プロセス中に潜在的な汚染物質を排除するために、サンプリング膜、DNA抽出キットに添加されたDNAのない水、およびシーケンスライブラリ準備キットに添加されたDNAのない水を含む12のネガティブコントロールが含まれました。 これらのネガティブコントロールは、61のOSサンプルとともにシーケンスされました。

メタゲノーム全体のシーケンスでは、抽出されたDNAをNebnext dsDNA Fragmentase（New England Biolabs、Inc.、Ipswich、MA、USA）を使用して断片化しました。 ライブラリの準備は、製造元のプロトコルに続いて、Swift 2S Turbo DNA Library Kit（Swift Biosciences、Inc。、米国）で実行されました。 浄化とサイズの選択は、Hiaccubead（Accugene、San Diego、CA、USA）を使用して実施されました。 インデックスPCRは、Swift 2Sターボコンビナトリアルデュアルインデックスプライマーキット（Swift Biosciences、Inc。）で実行され、その後、Hiaccubeadを使用した追加の精製とサイズの選択が行われました。 各サンプルのライブラリ濃度は、Qubit™DSDNA HSアッセイキット（Thermo Fisher Scientific、米国）を使用して定量化されました。 各ライブラリー（4nm）の等極濃度をプールし、イルミナnovaseq 6000システム（250 bpペアの端）で配列決定しました。

NovaseQシステムから取得した生の配列データは、前述のように処理されました（51、52）。 アダプターシーケンスをトリミングし、トリムモマティックを使用して品質フィルタリングを実行しました（53）。 Pear V.0.9.11（54）を使用して、ペアエンドシーケンスをマージしました。 メタゲノムデータのヒト由来配列を特定し、参照ヒトゲノムを使用してBBMAPを使用して除去しました。 分類群