Potencjalna rola mikrobiomu powierzchniowego oka w suchym oku: interakcje drobnoustrojowe i łagodzenie objawów

Projekt badania i pobieranie próbek Badanie To badanie jest randomizowane, podwójnie ślepe i prospektywne. Kryteria włączenia były następujące: pacjenci w wieku 19 lat lub starsi z objawami zespołu suchego oka. W sumie 50 uczestników przypisano losowo do grupy CSA (n = 25, cyklosporyna dwa razy dziennie i kwas hialuronowy dwa razy dziennie) lub do grupy kontrolnej (n = 25, kwas hialuronowy cztery razy dziennie). W tym badaniu zastosowano 0,05% cyklosporyny A (Cyporin N Krople oczu, Taejoon Pharm, Republic of Korea) i 0,15% kwasu hialuronowego (nowe krople do oczu Hyaluni, Pharm). Oszczędność utrzymywano przez oddzielenie egzaminatora i kolektora próbek.

Kryteria wykluczenia obejmowały zastosowanie miejscowych kropli oka lub leków ogólnoustrojowych (takich jak sterydy ogólnoustrojowe, immunomodulatory i tetracykliny), które mogłyby wpływać na wyniki badań, a także obecność zapalenia spojówek, przednie zapalenie dgłowa, infestacja drążka, infekcja pasożytniczy użycie lub dowolna zabieg chirurgiczny okulistyki w ciągu trzech miesięcy przed linią bazową. Ponadto wykluczono osoby z pojedynczym funkcjonalnym okiem, ciężarnymi lub karmiącymi piersią kobietom ryzykownym ciąży bez antykoncepcji.

Dane kliniczne i próbki OS zebrano na początku przed podaniem upuszczenia oczu (V1) i po 4 tygodniach (V2) i 12 tygodniach (V3) po rozpoczęciu leczenia (ryc. 1A). Spośród 50 uczestników V1 21 uczestników z każdej grupy zakończyło obserwację w V2, podczas gdy 14 uczestników grupy CSA i 18 uczestników grupy Newhyaluni pozostało w V3. Próbki OS do analizy mikrobiomu uzyskano z dolnej worka spojówkowego przy użyciu sterylnej membrany mieszanej celulozy (MCF) (Millipore, Merck). Próbki OS pobierano od 13 uczestników grupy CSA i 13 uczestników grupy Newhyaluni. Wszystkie próbki OS przechowywano w -80 ° C aż do ekstrakcji DNA do analizy mikrobiomu.

Objawy zbierania danych klinicznych oceniono za pomocą wskaźnika chorób powierzchni oka (OSDI), wizualnej skali analogowej (VAS) dla bólu i zmodyfikowanej standardowej oceny suszenia oka (prędkości). Stabilność filmu łzowego oceniono przez pomiar czasu rozpadu łez (TBUT). Barwienie fluoresceiny rogówki przeprowadzono przez zastosowanie kropli sterylnej soli fizjologicznej do sterylnego paska fluoresceiny. Po trzykrotnie trzykrotnie mrugniętym podmiot, czas między normalnym mruganiem a pierwszym wyglądem suchej plamki w filmie łzy. Do analizy zastosowano średnią z trzech powtarzanych pomiarów.

Zapalenie OS oceniono za pomocą oceny barwienia fluoresceiny (FSS) według systemu punktacji Oxford (50). Ciężkość gruczołów meibomicznych i zapalenia powiek, a także przekrwienie marginesu pokrywki, oceniono jako brak, łagodny, umiarkowany lub ciężki. Wydzielanie łez mierzono za pomocą Schirmer Strip bez znieczulenia. Pasek Schirmera umieszczono na czasowej trzeciej dolnej powieki, między dolną spojówką palpebral a spojówką dolnej bulwary. Po 5 minutach długości płynu łzowego wchłoniętego przez pasek mierzono w milimetrach.

Ekstrakcję DNA i całkowitą sekwencjonowanie metagenomu całkowitego DNA ekstrahowano ze zebranych próbek OS przy użyciu zestawu RNeasy Powermicrobiom (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). Stężenie DNA mierzono za pomocą biofotometru D30 przy użyciu μkuwetki G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Niemcy). Aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenia podczas procesu eksperymentalnego, uwzględniono 12 kontroli negatywnych, zawierających błony próbkowania, woda bez DNA dodana do zestawu do ekstrakcji DNA i woda bez DNA dodana do zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania. Te kontrole negatywne zsekwencjonowano wraz z próbkami 61 OS.

W przypadku całego sekwencjonowania metagenomu ekstrahowany DNA rozdrobniono przy użyciu fragmentazy dsDNA NEBNEXT (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Przygotowanie biblioteki przeprowadzono za pomocą zestawu biblioteki DNA Swift 2S Turbo DNA (Swift Biosciences, Inc., USA) zgodnie z protokołem producenta. Oczyszczenie i wybór wielkości przeprowadzono przy użyciu Hiaccubead (Accugene, San Diego, Kalifornia, USA). Indeks PCR przeprowadzono za pomocą zestawu kombinatorycznego podwójnego indeksowania Swift 2S Turbo (Swift Biosciences, Inc.), a następnie dodatkowym wyborem oczyszczania i wielkości za pomocą Hiaccubead. Stężenie biblioteki dla każdej próbki określono ilościowo przy użyciu zestawu testowego Qubit ™ DSDNA HS (Thermo Fisher Scientific, USA). Stężenia równomolowe każdej biblioteki (4 nm) połączono i zsekwencjonowano w systemie Illumina Novaseq 6000 (koniec 250 pz).

Dane dotyczące sekwencji surowej uzyskane z systemu Novaseq zostały przetworzone jak opisano wcześniej (51, 52). Sekwencje adapterów zostały przycięte, a filtrowanie jakości przeprowadzono za pomocą trimmomatycznej (53). Sekwencje z końcem sparowanego połączono za pomocą Pear V.0.9.11 (54). Sekwencje pochodzące od człowieka w danych metagenomu zidentyfikowano i usunięto za pomocą BBMAP z odniesienia ludzkiego genomu. Takson