Потенциальная роль поверхностного микробиома глаз в сухом глаза: микробные взаимодействия и облегчение симптомов

Дизайн исследования и сбор образцов Это исследование является рандомизированным, двойным слепым и проспективным исследованием. Критерии включения были следующими: пациенты в возрасте 19 лет и старше с симптомами синдрома сухого глаза. В общей сложности 50 участников были случайным образом назначены либо в группу CSA (n = 25, циклоспорин A два раза в день и гиалуроновую кислоту два раза в день), либо контрольную группу (n = 25, гиалуроновая кислота четыре раза в день). В этом исследовании использовали 0,05% циклоспорин А (ципорин -н -глазные капли, тэджун -фарм, Республика Корея) и 0,15% гиалуроновой кислоты (новые глазные капли Hyaluni, Taejoon Pharm). Слепевание поддерживалось путем разделения экзаменатора и коллектора выборки.

Критерии исключения включали использование местных капель глаз или системных препаратов (таких как системные стероиды, иммуномодуляторы и тетрациклины), которые могут влиять на исходы исследования, а также на наличие конъюнктивита, передний блефарит, инфицирование демодекса, паразитные глазные инфекции, нерешенные травмы, исцеляющие, исцеления, эерация, аэрация, аэрация, аэрация, аэрастические, контактные, исцеляющие, исцеления, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, аэрационные, нерешенные глазные, исцеления, исцеления. Использование линз или любая офтальмологическая хирургическая процедура в течение трех месяцев до исходного уровня. Кроме того, субъекты с одним функциональным глазом, беременными или грудными женщинами, и те, кто подвергался риску беременности без контрацепции, были исключены.

Клинические данные и образцы ОС были собраны на исходном уровне перед введением глазных каплей (V1) и через 4 недели (V2) и 12 недель (V3) после начала лечения (Fig. 1A). Из 50 участников V1 21 участник из каждой группы завершил последующее наблюдение в V2, в то время как 14 участников группы CSA и 18 участников в Newhyaluni Group остались на V3. Образцы ОС для анализа микробиомов были получены из нижнего конъюнктивального мешка с использованием стерильного смешанного целлюлозного эфира (MCF) мембраны (Millipore, Merck). Образцы ОС были собраны у 13 участников группы CSA и 13 участников Newhyaluni Group. Все образцы ОС хранили при -80 ° С до экстракции ДНК для анализа микробиомов.

Clinical data collection Symptoms were assessed using the Ocular Surface Disease Index (OSDI), Visual Analogue Scale (VAS) for pain, and the modified Standard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) questionnaire. Стабильность слезой пленки была оценена путем измерения времени разрыва слезы (TBUT). Окрашивание флуоресцеином роговицы проводили путем применения капли стерильного физиологического раствора на стерильную флуоресцеиновую полосу. После того, как субъект моргнул естественным образом три раза, было записано время между нормальным миганом и первым появлением сухого пятна в слезной пленке. Среднее из трех повторных измерений использовалось для анализа.

Воспаление ОС оценивали с использованием оценки окрашивания флуоресцеина (FSS), оцениваемой в соответствии с системой оценки Оксфорда (50). Тяжесть мейбомии и воспаления век, а также гиперемия края крышки была оценена как ни одна, легкая, умеренная или тяжелая. Секреция слезы измерялась с использованием полосы Ширмера без анестезии. Ширмерная полоса была помещена во временной трети нижнего века, между нижней пальпебральной конъюнктивой и конъюнктивой нижнего бульбара. Через 5 минут длина слезоточивой жидкости, поглощаемой полосой, измеряли в миллиметрах.

Экстракция ДНК и целый метагеном общая ДНК была извлечена из собранных образцов ОС с использованием набора Rneasy PowerMicrobiome (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния, США). Концентрацию ДНК измеряли с помощью биофотометра D30 с использованием μcuvette G1.0 (Eppendorf, Гамбург, Германия). Для устранения потенциальных загрязняющих веществ в ходе экспериментального процесса были включены 12 отрицательных контролей, включающие в себя отбор проб, без ДНК воды, добавленную в комплект для экстракции ДНК, и без ДНК воду, добавленную в комплект для получения библиотеки секвенирования. Эти отрицательные контроли были секвенированы вместе с образцами 61 ОС.

Для секвенирования цельного метагенома экстрагированная ДНК фрагментировали с использованием фрагментазы Nebnext DSDNA (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Подготовка библиотеки была выполнена с помощью Swift 2S Turbo DNA Library Kit (Swift Biosciences, Inc., США) после протокола производителя. Очистка и выбор размера проводились с использованием Hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA). Индекс ПЦР проводили с помощью набора для праймеров Swift Biosciences, Inc.) (Swift Biosciences, Inc.) с последующим дополнительным выбором очистки и размера с использованием Hiaccubead. Концентрацию библиотеки для каждого образца определяли количественно с использованием набора для анализа DSDNA QUBI ™ (Thermo Fisher Scientific, США). Эквимолярные концентрации каждой библиотеки (4 нм) объединяли и секвенировали в системе Illumina Novaseq 6000 (парный конец 250 п.н.).

Необработанные данные о последовательности, полученные из системы NovaseQ, обрабатывались, как описано ранее (51, 52). Адаптерные последовательности были обрезаны, а качественная фильтрация проводили с использованием триммоматического (53). Парные последовательности объединяли с использованием Pear v.0.9.11 (54). Последовательности, полученные из человека в данных метагенома, были идентифицированы и удалены с использованием BBMAP с эталонным геномом человека. Таксон