Potentielle Rolle des Augenoberflächenmikrobioms im trockenen Auge: mikrobielle Wechselwirkungen und Symptomlinderung

Studiendesign und Stichprobensammlung Diese Studie ist randomisiert, doppeltblind und prospektiv. Die Einschlusskriterien waren wie folgt: Patienten im Alter von 19 Jahren oder älter mit Symptomen des Trockenaugesyndroms. Insgesamt 50 Teilnehmer wurden entweder der CSA -Gruppe (n = 25, Cyclosporin A zweimal täglich und zweimal täglich Hyaluronsäure) oder der Kontrollgruppe (n = 25, Hyaluronsäure viermal täglich) zugeordnet. 0,05% Cyclosporin A (Cyporin n Augentropfen, Taejoon Pharm, Republik Korea) und 0,15% Hyaluronsäure (neue Hyaluni -Augentropfen, Taejoon Pharm) wurden in dieser Studie verwendet. Die Blenden wurde durch Trennen des Prüfers und des Probensammlers beibehalten.

Ausschlusskriterien umfassten die Verwendung topischer Augentropfen oder systemischer Medikamente (wie systemische Steroide, Immunmodulatoren und Tetracycline), die die Ergebnisse der Studie beeinflussen könnten Keratoplastik, Kontaktlinsengebrauch oder ein ophthalmisches chirurgisches Verfahren innerhalb von drei Monaten vor dem Ausgangswert. Darüber hinaus wurden Probanden mit einem einzigen funktionellen Auge, schwangeren oder stillenden Frauen und denjenigen, die eine Schwangerschaft ohne Empfängnisverhütung ausgesetzt sind, ausgeschlossen.

Klinische Daten und OS -Proben wurden zu Studienbeginn vor der Verabreichung von Augentropfen (V1) und nach 4 Wochen (V2) und 12 Wochen (V3) nach der Behandlungsinitiierung (Abb. 1A) gesammelt. Von den 50 Teilnehmern von V1 absolvierten 21 Teilnehmer jeder Gruppe die Nachuntersuchung bei V2, während 14 Teilnehmer der CSA-Gruppe und 18 Teilnehmer der Newhyaluni-Gruppe bei V3 blieben. OS -Proben für die Mikrobiomanalyse wurden aus der minderwertigen Konjunktivalsack unter Verwendung einer sterilen Mixed Celluloseester (MCF) -Membran (Millipore, Merck) erhalten. OS -Proben wurden von 13 Teilnehmern der CSA -Gruppe und 13 Teilnehmern der Newhyaluni -Gruppe gesammelt. Alle OS -Proben wurden bis zur DNA -Extraktion für die Mikrobiomanalyse bei -80 ° C gelagert.

Die Symptome der klinischen Datenerfassung wurden unter Verwendung des OCULAR OCOME SACUL OUPER CROUNTY Index (OSDI), der visuellen Analogskala (VAS) für Schmerzen und des modifizierten Fragebogens zur modifizierten Standardpatienten der Augen Trockness (Geschwindigkeit) bewertet. Die Stabilität des Tränenfilms wurde durch Messung der Reißbrennungszeit (TBUT) bewertet. Die Fluoresceinfärbung der Hornhaut wurde durch Auftragen eines Tropfens steriler Kochsalzlösung auf einen sterilen Fluoresceinstreifen durchgeführt. Nachdem das Subjekt dreimal natürlich blinzelte, wurde die Zeit zwischen einem normalen Blinzeln und dem ersten Auftritt eines trockenen Flecks im Tränenfilm aufgezeichnet. Der Durchschnitt von drei wiederholten Messungen wurde zur Analyse verwendet.

Die OS -Entzündung wurde unter Verwendung des Fluorescein -Färbungswerts (FSS) bewertet, der gemäß dem Oxford Scoring System (50) bewertet wurde. Die Schwere der meibomischen Drüsen und der Augenlidentzündung sowie der Hyperämie der Deckelmarge wurde als keine, leicht, mittelschwer oder schwerwiegend bewertet. Die Tränensekretion wurde mit dem Schirmer -Streifen ohne Anästhesie gemessen. Ein Schirmer -Streifen wurde am temporalen Drittel des unteren Augenlids zwischen der unteren Palpebral -Konjunktiva und der unteren Bulbar -Konjunktiva platziert. Nach 5 min wurde die vom Streifen absorbierte Länge der Tränenflüssigkeit in Millimetern gemessen.

Die DNA -Extraktion und die GesamtdNA der gesamten Metagenomsequenzierung wurden aus den gesammelten OS -Proben unter Verwendung des RNeasy PowerMicrobiome -Kits (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) extrahiert. Die DNA -Konzentration wurde mit einem Biophotometer D30 unter Verwendung eines μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gemessen. Um potenzielle Kontaminanten während des experimentellen Prozesses zu beseitigen, wurden 12 Negativkontrollen eingeschlossen, die Probenahmemembranen, DNA-freies Wasser zum DNA-Extraktionskit und DNA-freies Wasser zum Vorbereitungskit der Sequenzbibliothek zugesetzt wurden. Diese negativen Kontrollen wurden neben den 61 OS -Proben sequenziert.

Für die gesamte Metagenomsequenzierung wurde extrahierte DNA unter Verwendung von Nebnext dsDNA -Fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA) fragmentiert. Die Bibliotheksvorbereitung wurde nach dem Protokoll des Herstellers mit einem Swift 2S Turbo -DNA -Bibliothekskit (Swift Biosciences, Inc., USA) durchgeführt. Reinigungs- und Größenauswahl wurden unter Verwendung von HIACCUBEAD (Accugene, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die Index -PCR wurde mit dem Swift 2S -Turbo -Dual -Indexierungs -Primer -Kit (Swift Biosciences, Inc.) durchgeführt, gefolgt von einer zusätzlichen Reinigungs- und Größenauswahl unter Verwendung von HIACCubead. Die Bibliothekskonzentration für jede Probe wurde unter Verwendung des Qubit ™ DSDNA HS -Assay -Kits (Thermo Fisher Scientific, USA) quantifiziert. Die äquimolaren Konzentrationen jeder Bibliothek (4nm) wurden gepoolt und auf einem Illumina Novaseq 6000-System (250-bp-gepaartes Ende) sequenziert.

RAW -Sequenzdaten, die aus dem Novaseq -System erhalten wurden, wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet (51, 52). Adaptersequenzen wurden beschnitten und die Qualitätsfilterung wurde unter Verwendung von Trimmomatie (53) durchgeführt. Paired-End-Sequenzen wurden unter Verwendung von Pear V.0.9.11 (54) zusammengeführt. Von Menschen abgeleitete Sequenzen in den Metagenomdaten wurden mithilfe von BBMAP mit einem menschlichen Referenzgenom identifiziert und entfernt. Taxon