Papel potencial do microbioma da superfície ocular no olho seco: interações microbianas e alívio dos sintomas

Desenho do estudo e coleta de amostras Este estudo é randomizado, duplo-cego e prospectivo. Os critérios de inclusão foram os seguintes: pacientes com 19 anos ou mais com sintomas de síndrome do olho seco. Um total de 50 participantes foi designado aleatoriamente ao grupo CSA (n = 25, ciclosporina duas vezes ao dia e ácido hialurônico duas vezes ao dia) ou ao grupo controle (n = 25, ácido hialurônico quatro vezes ao dia). A 0,05% de ciclosporina A (colírios Cyporin N, Taejoon Pharm, República da Coréia) e ácido hialurônico a 0,15% (novos colírios Hyaluni, Taejoon Pharm) foram utilizados neste estudo. O cego foi mantido separando o examinador e o coletor da amostra.

Exclusion criteria included the use of topical ocular drops or systemic medication (such as systemic steroids, immunomodulators, and tetracyclines) that could influence study outcomes, as well as the presence of conjunctivitis, anterior blepharitis, Demodex infestation, parasitic eye infections, unresolved ocular trauma, healing disorders of the OS, a history of penetrating keratoplasty, contact Uso das lentes, ou qualquer procedimento cirúrgico oftálmico dentro de três meses antes da linha de base. Além disso, foram excluídos indivíduos com um único olho funcional, mulheres grávidas ou amamentando, e aqueles em risco de gravidez sem contracepção foram excluídos.

Dados clínicos e amostras de SO foram coletados na linha de base antes da administração de colírios (V1) e às 4 semanas (V2) e 12 semanas (V3) após o início do tratamento (Fig. 1A). Dos 50 participantes da V1, 21 participantes de cada grupo concluíram o acompanhamento no V2, enquanto 14 participantes do grupo CSA e 18 participantes do grupo Newhyaluni permaneceram na V3. As amostras de SO para análise de microbiomas foram obtidas do saco conjuntival inferior usando a membrana estéril de celulose mista estéril (MCF) (Millipore, Merck). As amostras de SO foram coletadas de 13 participantes do grupo CSA e 13 participantes do grupo Newhyaluni. Todas as amostras do sistema operacional foram armazenadas a -80 ° C até a extração do DNA para análise de microbiomas.

Os sintomas de coleta de dados clínicos foram avaliados usando o Índice de Doenças da Superfície Ocular (OSDI), Escala Visual Analógica (VAS) para dor e a avaliação padrão do paciente modificada do questionário de secura ocular (velocidade). A estabilidade do filme lacrimal foi avaliada medindo o tempo de quebra de lágrimas (TBUT). A coloração de fluoresceína da córnea foi realizada aplicando uma gota de solução salina estéril a uma tira de fluoresceína estéril. Depois que o sujeito piscou naturalmente três vezes, foi gravado o tempo entre um piscar de olhos e a primeira aparição de um ponto seco no filme lacrimal. A média de três medições repetidas foi usada para análise.

A inflamação do SO foi avaliada usando o escore de coloração com fluoresceína (FSS) classificado de acordo com o sistema de pontuação de Oxford (50). A gravidade das glândulas meibomianas e inflamação palpebral, bem como a hiperemia da margem da tampa, foi classificada como nenhuma, leve, moderada ou severa. A secreção lacrimal foi medida usando a faixa de Schirmer sem anestesia. Uma faixa de Schirmer foi colocada no terço temporal da pálpebra inferior, entre a conjuntiva palpebral inferior e a conjuntiva inferior do bulbar. Após 5 min, o comprimento do líquido lacrimal absorvido pela tira foi medido em milímetros.

A extração de DNA e o DNA total do sequenciamento de metagenoma inteiro foram extraídos das amostras de OS coletadas usando o kit RNeasy PowerMicrobiome (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA). A concentração de DNA foi medida com um biofotômetro D30 usando um μCuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Para eliminar os contaminantes em potencial durante o processo experimental, foram incluídos 12 controles negativos, compreendendo amostragem de membranas, água livre de DNA adicionada ao kit de extração de DNA e água livre de DNA adicionada ao kit de preparação da biblioteca de sequenciamento. Esses controles negativos foram sequenciados juntamente com as 61 amostras do sistema operacional.

Para sequenciamento de metagenoma inteiro, o DNA extraído foi fragmentado usando o Nebnext DSDNA Fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, EUA). A preparação da biblioteca foi realizada com um kit Swift 2S Turbo DNA Library (Swift Biosciences, Inc., EUA) seguindo o protocolo do fabricante. A purificação e a seleção de tamanho foram realizadas usando HiACCUBEAD (Accugene, San Diego, CA, EUA). O PCR do índice foi realizado com o kit Swift 2S Turbo Combinatorial Combinatorial Indexing Primer (Swift Biosciences, Inc.), seguido de purificação adicional e seleção de tamanho usando HiACCUBEAD. A concentração da biblioteca para cada amostra foi quantificada usando o kit de ensaio qubit ™ dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, EUA). As concentrações equimolares de cada biblioteca (4nm) foram agrupadas e sequenciadas em um sistema Illumina Novaseq 6000 (extremidade emparelhada de 250 pb).

Os dados de sequência bruta obtidos no sistema Novaseq foram processados ​​como descrito anteriormente (51, 52). As sequências adaptadoras foram aparadas e a filtragem de qualidade foi realizada usando TRMMOMOMATIC (53). As sequências de extremidade pareada foram mescladas usando a pêra V.0.9.11 (54). As sequências derivadas do homem nos dados do metagenoma foram identificadas e removidas usando BBMAP com um genoma humano de referência. Taxon