Potensiell rolle av okulær overflate mikrobiom i tørt øye: mikrobielle interaksjoner og symptomlindring

Studiedesign og prøveinnsamling Denne studien er randomisert, dobbeltblind og prospektiv studie. Inkluderingskriteriene var som følger: pasienter i alderen 19 år eller eldre med symptomer på tørt øyesyndrom. Totalt 50 deltakere ble tilfeldig tildelt enten CSA -gruppen (n = 25, syklosporin en to ganger om dagen og hyaluronsyre to ganger daglig) eller kontrollgruppen (n = 25, hyaluronsyre fire ganger daglig). 0,05% Cyclosporine A (cyporin n øyedråper, Taejoon Pharm, Republikken Korea) og 0,15% hyaluronsyre (nye hyaluni øyedråper, Taejoon Pharm) ble brukt i denne studien. Blinding ble opprettholdt ved å skille sensor og prøvesamler.

Eksklusjonskriterier inkluderte bruk av aktuelle okulære dråper eller systemiske medisiner (for eksempel systemiske steroider, immunmodulatorer og tetracykliner) som kan påvirke studieutfall, så vel som tilstedeværelsen av konjunktivitt, anterior blefaritt, demodex infestasjon, parasitisk øyeinfeksjoner, uoppløselig trasuma -trasuma, parasitisk øye -infeksjoner, uoppløselig trasert trasert trasert trasert trauma, parasitisk øye -infeksjoner, uoppløselig trasitisk, og uoppdraget. Keratoplastikk, bruk av kontaktlinser eller hvilken som helst oftalmisk kirurgisk prosedyre innen tre måneder før grunnlinjen. I tillegg ble personer med et enkelt funksjonelt øye, gravide eller ammende kvinner, og de som var utsatt for graviditet uten prevensjon ekskludert.

Kliniske data og OS -prøver ble samlet ved baseline før administrering av øyedråpe (V1) og ved 4 uker (V2) og 12 uker (V3) etter behandlingsinitiering (fig. 1A). Av de 50 deltakerne på V1 fullførte 21 deltakere fra hver gruppe oppfølging hos V2, mens 14 deltakere i CSA-gruppen og 18 deltakere i Newhyaluni-gruppen forble på V3. OS -prøver for mikrobiomanalyse ble oppnådd fra den underordnede konjunktival SAC ved bruk av steril blandet celluloseester (MCF) membran (Millipore, Merck). OS -prøver ble samlet fra 13 deltakere i CSA -gruppen og 13 deltakere i Newhyaluni -gruppen. Alle OS -prøver ble lagret ved -80 ° C inntil DNA -ekstraksjon for mikrobiomanalyse.

Kliniske datainnsamlingssymptomer ble vurdert ved bruk av Ocular Surface Disease Index (OSDI), Visual Analogue Scale (VAS) for smerter, og den modifiserte standardpasientens evaluering av spørreskjema for øyetørke (hastighet). Tårfilmstabilitet ble evaluert ved å måle riveoppbruddstiden (TBUT). Fluoresceinfarging av hornhinnen ble utført ved å påføre en dråpe sterilt saltvann på en steril fluoresceinstripe. Etter at emnet blinket naturlig tre ganger, ble tiden mellom et normalt blink og det første utseendet til et tørt sted i tårefilmen spilt inn. Gjennomsnittet av tre gjentatte målinger ble brukt til analyse.

OS -betennelse ble vurdert ved bruk av fluoresceinfargingsscore (FSS) gradert i henhold til Oxford -scoringssystemet (50). Alvorlighetsgraden av meibomiske kjertler og øyelokkbetennelse, så vel som lokkemarginhyperemi, ble gradert som ingen, mild, moderat eller alvorlig. Tåresekresjon ble målt ved bruk av Schirmer -stripen uten bedøvelse. En Schirmer -stripe ble plassert ved den tidsmessige tredjedelen av det nedre øyelokket, mellom den nedre palpebrale konjunktiva og den nedre bulbar -konjunktiva. Etter 5 minutter ble lengden på tårefluid som ble absorbert av stripen målt i millimeter.

DNA -ekstraksjon og hele metagenomsekvensering Totalt DNA ble ekstrahert fra de samlede OS -prøvene ved bruk av RNeasy Powermicrobiome Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). DNA -konsentrasjon ble målt med et biofotometer D30 ved bruk av en μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). For å eliminere potensielle forurensninger under den eksperimentelle prosessen, ble 12 negative kontroller inkludert, omfattende prøvetakingsmembraner, DNA-fritt vann tilsatt DNA-ekstraksjonssettet og DNA-fritt vann tilsatt til Sequencing Library Preparation Kit. Disse negative kontrollene ble sekvensert ved siden av 61 OS -prøvene.

For hele metagenomsekvensering ble ekstrahert DNA fragmentert ved bruk av NebNext DSDNA -fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Bibliotekforberedelse ble utført med et Swift 2S Turbo DNA Library Kit (Swift Biosciences, Inc., USA) etter produsentens protokoll. Rensing og valg av størrelse ble utført ved bruk av Hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA). Indeks PCR ble utført med SWIFT 2S Turbo Combinatorial Dual Indexing Primer Kit (Swift Biosciences, Inc.), etterfulgt av ytterligere rensing og valg av størrelse ved bruk av HiacCubead. Bibliotekskonsentrasjonen for hver prøve ble kvantifisert ved bruk av Qubit ™ DSDNA HS -analysesettet (Thermo Fisher Scientific, USA). Ekimolare konsentrasjoner av hvert bibliotek (4nm) ble samlet og sekvensert på et Illumina Novaseq 6000-system (250 bp sammenkoblet ende).

Rå sekvensdata hentet fra Novaseq -systemet ble behandlet som tidligere beskrevet (51, 52). Adaptersekvenser ble trimmet, og kvalitetsfiltrering ble utført ved bruk av trimmomatisk (53). Sammenkoblede sekvenser ble slått sammen ved bruk av pære v.0.9.11 (54). Human-avledede sekvenser i metagenomdataene ble identifisert og fjernet ved bruk av BBMAP med et referanse humant genom. Taxon