건조한 안구에서 안구 표면 미생물 군의 잠재적 역할 : 미생물 상호 작용 및 증상 완화

연구 설계 및 샘플 수집이 연구는 무작위, 이중 맹검 및 전향 적 시험입니다. 포함 기준은 다음과 같습니다. 안구 건조 증후군 증상이있는 19 세 이상의 환자. 총 50 명의 참가자가 CSA 그룹 (n = 25, 하루에 두 번 Cyclosporine A 및 히알루 론산 A) 또는 대조군 (n = 25, 히알루 론산 매일 4 회 4 회)에 무작위로 배정되었습니다. 0.05% Cyclosporine A (Cyporin n Eye Drops, Taejoon Pharm, Lorian Republic) 및 0.15% 히알루 론산 (New Hyaluni Eye Drops, Taejoon Pharm) 이이 연구에서 사용되었습니다. 검사관과 샘플 수집기를 분리하여 눈을 멀게 유지했습니다.

배제 기준에는 국소 안구 방울 또는 전신 약물 (예 : 연구 결과에 영향을 줄 수있는 전신 스테로이드, 면역 조절제 및 테트라 사이클린)과 결막염의 존재, 전방 보장염, 데모 덱스 감염, 기생 눈 감염, 기발 성 외상성, os의 병력, 성서의 역사, 성적 이어질 성과의 장애가 포함되었습니다. 기준선 3 개월 이내에 사용 또는 안과 수술 절차를 사용하십시오. 또한, 단일 기능적 눈, 임신 또는 모유 수유 여성을 가진 대상 및 피임없이 임신 위험이있는 피험자는 제외되었습니다.

임상 데이터 및 OS 샘플은 시선 드롭 투여 전 (V1) 및 4 주 (V2) 및 12 주 (v3)에서 치료 개시 (도 1A)에서 수집되었다 (도 1A). V1의 50 명의 참가자 중 각 그룹의 21 명의 참가자는 V2에서 후속 조치를 마쳤으며 CSA 그룹의 14 명과 Newhyaluni 그룹의 18 명의 참가자는 V3에 남아있었습니다. 미생물 분석을위한 OS 샘플은 멸균 혼합 셀룰로오스 에스테르 (MCF) 막 (Millipore, Merck)을 사용하여 열등한 결막 SAC로부터 얻었다. OS 샘플은 CSA 그룹의 13 명의 참가자와 Newhyaluni 그룹의 13 명의 참가자로부터 수집되었습니다. 모든 OS 샘플을 미생물 분석을 위해 DNA 추출까지 -80 ℃에서 저장 하였다.

임상 데이터 수집 증상은 통증에 대한 안구 표면 질병 지수 (OSDI), 시각적 아날로그 척도 (VAS) 및 안구 건조 (속도) 설문지의 수정 된 표준 환자 평가를 사용하여 평가되었습니다. 찢어짐 분해 시간 (TBUT)을 측정하여 찢김 필름 안정성을 평가 하였다. 각막의 플루오 레세 인 염색은 멸균 플루오 레세 인 스트립에 멸균 식염수 한 방울을 적용함으로써 수행되었다. 피험자가 자연스럽게 3 번 깜박임 후, 정상적인 깜박임과 눈물 필름에서 건조한 지점의 첫 번째 모양 사이의 시간이 기록되었습니다. 3 개의 반복 측정의 평균을 분석에 사용 하였다.

OS 염증은 옥스포드 스코어링 시스템 (50)에 따라 채점 된 플루오 레세 인 염색 점수 (FSS)를 사용하여 평가되었다. 뚜껑 마진 고혈증뿐만 아니라 meibomian 땀샘 및 눈꺼풀 염증의 심각성은 등급이 지정되어 있지 않거나 온화하거나 중증으로 등급이 매겨졌습니다. 마취가없는 Schirmer 스트립을 사용하여 최루 분비를 측정 하였다. Schirmer 스트립은 하부 눈꺼풀의 시간 3 분의 1에, 하부 palpebral 결막과 하부 전구 결막 사이에 배치되었다. 5 분 후, 스트립에 의해 흡수 된 끼 유체의 길이를 밀리미터로 측정 하였다.

DNA 추출 및 전체 메타 게놈 시퀀싱 총 DNA를 RNeasy PowerMicrobiome Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여 수집 된 OS 샘플로부터 추출 하였다. DNA 농도는 μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Germany)을 사용하여 생물 포트 미터 D30으로 측정 하였다. 실험 과정에서 잠재적 오염 물질을 제거하기 위해, 샘플링 막, DNA 추출 키트에 첨가 된 DNA없는 물 및 시퀀싱 라이브러리 제조 키트에 첨가 된 DNA없는 물을 포함하는 12 개의 음성 대조군이 포함되었다. 이러한 음성 대조군은 61 개의 OS 샘플과 함께 시퀀싱되었다.

전체 메타 게놈 시퀀싱을 위해, 추출 된 DNA를 NEBNEXT DSDNA Fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, USA)를 사용하여 단편화 하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Swift 2S Turbo DNA Library Kit (Swift Biosciences, Inc., USA)로 라이브러리 준비를 수행 하였다. 정제 및 크기 선택은 Hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. Index PCR은 Swift 2S Turbo Combinatorial Dual Indexing Primer Kit (Swift Biosciences, Inc.)로 수행 한 후 Hiaccubead를 사용하여 추가 정제 및 크기 선택으로 수행 하였다. 각각의 샘플에 대한 라이브러리 농도는 Qubit ™ dsDNA HS 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 정량화되었다. 각 라이브러리 (4NM)의 등몰 농도를 풀라 미나 NovaseQ 6000 시스템 (250-bp 쌍 끝)에서 시퀀싱 하였다.

NovaseQ 시스템으로부터 얻은 원시 서열 데이터는 전술 한 바와 같이 처리되었다 (51, 52). 어댑터 시퀀스를 트리밍하고, 트리밍 (53)을 사용하여 품질 필터링을 수행 하였다. 한 쌍의 엔드 서열은 배 V.0.9.11 (54)을 사용하여 병합되었다. 메타 게놈 데이터에서 인간-유래 서열을 참조 인간 게놈으로 BBMAP를 사용하여 확인하고 제거 하였다. 분류군