Ruolo potenziale del microbioma di superficie oculare nell'occhio secco: interazioni microbiche e alleviazione dei sintomi

Progettazione dello studio e raccolta di campioni Questo studio è randomizzato, in doppio cieco e di studio prospettico. I criteri di inclusione erano i seguenti: pazienti di età pari o superiore a 19 anni con sintomi della sindrome degli occhi secchi. Un totale di 50 partecipanti sono stati assegnati in modo casuale al gruppo CSA (n = 25, ciclosporina A due volte al giorno e acido ialuronico due volte al giorno) o al gruppo di controllo (n = 25, acido ialuronico quattro volte al giorno). Lo 0,05% di ciclosporina A (colliri di Cyporrin N occhiali, Taejoon Pharm, Repubblica di Corea) e acido ialuronico allo 0,15% (nuovi colli per gli occhi Hyaluni, Taejoon Pharm) sono stati utilizzati in questo studio. L'accecamento è stato mantenuto separando l'esaminatore e il collettore di campioni.

I criteri di esclusione includevano l'uso di gocce oculari topiche o farmaci sistemici (come steroidi sistemici, immunomodulatori e tetracicline) che potevano influenzare gli esiti dello studio, nonché la presenza di congiuntivite congiunti, una storia di Keratopty anteriore, una storia di KeratOplate anteriore. Utilizzare o qualsiasi procedura chirurgica oftalmica entro tre mesi prima del basale. Inoltre, sono stati esclusi i soggetti con un singolo occhio funzionale, in gravidanza o in allattamento al seno e quelli a rischio di gravidanza senza contraccezione.

I dati clinici e i campioni di OS sono stati raccolti al basale prima della somministrazione di colliri (V1) e a 4 settimane (V2) e 12 settimane (V3) dopo l'inizio del trattamento (Fig. 1A). Dei 50 partecipanti a V1, 21 partecipanti di ciascun gruppo hanno completato il follow-up presso V2, mentre 14 partecipanti al gruppo CSA e 18 partecipanti al gruppo Newhyaluni sono rimasti a V3. I campioni di OS per l'analisi del microbioma sono stati ottenuti dal sacco congiuntivale inferiore usando la membrana sterile di cellulosa mista (MCF) (Millipore, Merck). I campioni di OS sono stati raccolti da 13 partecipanti al gruppo CSA e 13 partecipanti al gruppo di Newhyaluni. Tutti i campioni di OS sono stati conservati a -80 ° C fino all'estrazione del DNA per l'analisi del microbioma.

I sintomi di raccolta dei dati clinici sono stati valutati utilizzando l'indice della malattia di superficie oculare (OSDI), la scala analogica visiva (VAS) per il dolore e il questionario modificato di valutazione standard del paziente del paziente (velocità). La stabilità del film lacrimale è stata valutata misurando il tempo di rottura della lacrima (TBUT). La colorazione della fluoresceina della cornea è stata eseguita applicando una goccia di soluzione salina sterile a una striscia sterile di fluoresceina. Dopo che il soggetto ha battuto le palpebre naturalmente tre volte, è stato registrato il tempo tra un batter d'occhio normale e la prima apparizione di un punto secco nel film lacrimale. La media di tre misurazioni ripetute è stata utilizzata per l'analisi.

L'infiammazione dell'OS è stata valutata utilizzando il punteggio di colorazione della fluoresceina (FSS) classificata secondo il sistema di punteggio di Oxford (50). La gravità delle ghiandole meibomiche e dell'infiammazione delle palpebre, così come l'iperemia del margine di coperchio, è stata classificata come nessuna, lieve, moderata o grave. La secrezione di lacrime è stata misurata usando la striscia Schirmer senza anestesia. Una striscia di Schirmer fu posizionata al terzo temporale della palpebra inferiore, tra la congiuntiva palpebrale inferiore e la congiuntiva di bulbare inferiore. Dopo 5 minuti, la lunghezza del fluido lacrimale assorbito dalla striscia è stata misurata in millimetri.

L'estrazione del DNA e il sequenziamento del metagenoma intero DNA sono stati estratti dai campioni di OS raccolti usando il kit RNeasy Powermicrobiome (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). La concentrazione di DNA è stata misurata con un biofotometro D30 usando una μCuvette G1.0 (Eppendorf, Amburgo, Germania). Per eliminare i potenziali contaminanti durante il processo sperimentale, sono stati inclusi 12 controlli negativi, comprendenti membrane di campionamento, acqua senza DNA aggiunta al kit di estrazione del DNA e acqua senza DNA aggiunta al kit di preparazione della libreria di sequenziamento. Questi controlli negativi sono stati sequenziati accanto ai 61 campioni di sistema operativo.

Per il sequenziamento del metagenoma intero, il DNA estratto è stato frammentato usando la frammentasi NEBNEXT DSDNA (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). La preparazione della biblioteca è stata eseguita con un kit Swift 2S Turbo DNA Library (Swift Biosciences, Inc., USA) seguendo il protocollo del produttore. La selezione di purificazione e dimensioni è stata condotta utilizzando Hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA). L'indice PCR è stato effettuato con il kit di primer a doppia indicizzazione combinatoria Swift 2S Turbo (Swift Biosciences, Inc.), seguito da ulteriore purificazione e selezione delle dimensioni usando Hiaccubead. La concentrazione di biblioteca per ciascun campione è stata quantificata utilizzando il kit di dosaggio Qubit ™ dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, USA). Le concentrazioni equimolari di ciascuna libreria (4nm) sono state raggruppate e sequenziate su un sistema Illumina novaseq 6000 (estremità accoppiata da 250 bp).

I dati di sequenza grezza ottenuti dal sistema NovaseQ sono stati elaborati come precedentemente descritto (51, 52). Le sequenze di adattatori sono state tagliate e il filtraggio di qualità è stato eseguito utilizzando Trimmomatic (53). Le sequenze di fascia abbinata sono state unite usando Pear V.0.9.11 (54). Le sequenze derivate dall'uomo nei dati del metagenoma sono state identificate e rimosse usando BBMAP con un genoma umano di riferimento. Taxon