Potentiële rol van oculair oppervlakmicrobioom in droge ogen: microbiële interacties en symptoomverlichting

Studieontwerp en monsterverzameling Deze studie is gerandomiseerd, dubbelblind en prospectieve proef. De inclusiecriteria waren als volgt: patiënten van 19 jaar of ouder met symptomen van het droge oogsyndroom. Een totaal van 50 deelnemers werden willekeurig toegewezen aan de CSA -groep (n = 25, cyclosporine A tweemaal per dag en hyaluronzuur tweemaal daags) of de controlegroep (n = 25, hyaluronzuur vier keer per dag). 0,05% cyclosporine A (Cyporin N oogdruppels, Taejoon Pharm, Republiek Korea) en 0,15% hyaluronzuur (nieuwe Hyaluni Eye Drops, Taejoon Pharm) werden in deze studie gebruikt. Verblinden werd gehandhaafd door de onderzoeker en de monsterverzamelaar te scheiden.

Uitsluitingscriteria omvatten het gebruik van actuele oculaire druppels of systemische medicatie (zoals systemische steroïden, immunomodulatoren en tetracyclines) die de onderzoeksresultaten kunnen beïnvloeden, evenals de aanwezigheid van conjunctivitis, voorste blefaritis, demodex -besmetting, parasitaire oogontsteking, parasitaire oogontsteking, parasitaire oogontsteking, parasitaire ooginvoering, contact opnemen met de penetratie van het os, een geschiedenis van het os, een geschiedenis van het os, een geschiedenis van het os, een geschiedenis van het os, een geschiedenis Lensgebruik, of enige oftalmische chirurgische procedure binnen drie maanden vóór de basislijn. Bovendien werden proefpersonen met een enkel functioneel oog, zwangere of borstvoederende vrouwen, en degenen die het risico lopen op zwangerschap zonder anticonceptie uitgesloten.

Klinische gegevens en OS -monsters werden verzameld bij aanvang vóór de toediening van de oogdruppel (V1) en na 4 weken (V2) en 12 weken (V3) na de initiatie van de behandeling (Fig. 1A). Van de 50 deelnemers aan V1 voltooiden 21 deelnemers van elke groep de follow-up op V2, terwijl 14 deelnemers aan de CSA Group en 18 deelnemers aan de Newhyaluni-groep op V3 bleven. OS -monsters voor microbioomanalyse werden verkregen uit de inferieure conjunctivale SAC met behulp van steriele gemengde celluloseester (MCF) membraan (Millipore, Merck). OS -monsters werden verzameld van 13 deelnemers aan de CSA -groep en 13 deelnemers aan de Newhyaluni -groep. Alle OS -monsters werden bewaard bij -80 ° C tot DNA -extractie voor microbioomanalyse.

Symptomen van klinische gegevensverzameling werden beoordeeld met behulp van de Ocular Surface Disease Index (OSDI), Visual Analoge Scale (VAS) voor pijn en de gemodificeerde standaardpatiëntevaluatie van Eye Droogness (Speed) -vragenlijst. Scheurfilmstabiliteit werd geëvalueerd door de traanuitbraaktijd (TBUT) te meten. Fluoresceïne -kleuring van het hoornvlies werd uitgevoerd door een druppel steriele zoutoplossing aan een steriele fluoresceïne -strip aan te brengen. Nadat het onderwerp driemaal op natuurlijke wijze knipperde, werd de tijd tussen een normale knippering en de eerste verschijning van een droge plek in de traanfilm opgenomen. Het gemiddelde van drie herhaalde metingen werd gebruikt voor analyse.

OS -ontsteking werd beoordeeld met behulp van de fluoresceïne -kleuringscore (FSS) gereguleerd volgens het Oxford -scoresysteem (50). De ernst van Meibomiaanse klieren en ooglidontsteking, evenals dekselmarge hyperemie, werd beoordeeld als geen, mild, matig of ernstig. Scheurafscheiding werd gemeten met behulp van de Schirmer -strip zonder anesthesie. Een Schirmer -strip werd geplaatst op het tijdelijke derde van het onderste ooglid, tussen de lagere palpebrale conjunctiva en de onderste bulbar conjunctiva. Na 5 minuten werd de lengte van de traanvloeistof die door de strook werd geabsorbeerd in millimeters gemeten.

DNA -extractie en volledig metagenoomsequencing Totaal DNA werden geëxtraheerd uit de verzamelde OS -monsters met behulp van de RNeasy PowerMicrobiome Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, VS). DNA -concentratie werd gemeten met een biofotometer D30 met behulp van een μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Om potentiële verontreinigingen tijdens het experimentele proces te elimineren, werden 12 negatieve controles opgenomen, bestaande uit bemonsteringsmembranen, DNA-vrij water toegevoegd aan de DNA-extractiekit en DNA-vrij water toegevoegd aan de voorbereidingskit van de sequencingbibliotheek. Deze negatieve controles werden gesequenced naast de 61 OS -monsters.

Voor hele metagenoomsequencing werd geëxtraheerde DNA gefragmenteerd met behulp van nebnext dsDNA fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, VS). Bibliotheekvoorbereiding werd uitgevoerd met een Swift 2S Turbo DNA -bibliotheekkit (Swift Biosciences, Inc., VS) volgens het protocol van de fabrikant. Zuivering en selectie van grootte werden uitgevoerd met behulp van HiacCubead (Accugene, San Diego, CA, VS). Index PCR werd uitgevoerd met de Swift 2S Turbo Combinatorial Dual Indexing Primer Kit (Swift Biosciences, Inc.), gevolgd door aanvullende zuivering en selectie van grootte met behulp van HiacCubead. De bibliotheekconcentratie voor elk monster werd gekwantificeerd met behulp van de QUBIT ™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, VS). Equimolaire concentraties van elke bibliotheek (4nm) werden samengevoegd en gesequenced op een Illumina Novaseq 6000-systeem (gepaard met 250 bp).

Ruwe sequentiegegevens verkregen uit het NOVASEQ -systeem werden verwerkt zoals eerder beschreven (51, 52). Adaptersequenties werden getrimd en kwaliteitsfiltering werd uitgevoerd met trimmomatisch (53). Gepaarde-end reeksen werden samengevoegd met Pear v.0.9.11 (54). Van menselijke afkomstige sequenties in de metagenoomgegevens werden geïdentificeerd en verwijderd met behulp van BBMAP met een referentie menselijk genoom. Taxon