眼表微生物组在干眼中的潜在作用：微生物相互作用和症状减轻

研究设计和样本收集此研究是随机的，双盲和前瞻性试验。 纳入标准如下：19岁以上患有干眼综合征症状的患者。 总共50名参与者被随机分配到CSA组（N = 25，每天两次环孢菌素，每天两次）或对照组（n = 25，每天四次）。 在这项研究中，使用了0.05％环孢菌素A（Cyporin N眼滴，Taejoon Pharm，Taejoon Pharm）和0.15％的透明质酸（新的Hyaluni眼滴，Taejoon Pharm）。 通过将检查者和样品收集器分开来保持盲目性。

Exclusion criteria included the use of topical ocular drops or systemic medication (such as systemic steroids, immunomodulators, and tetracyclines) that could influence study outcomes, as well as the presence of conjunctivitis, anterior blepharitis, Demodex infestation, parasitic eye infections, unresolved ocular trauma, healing disorders of the OS, a history of penetrating keratoplasty,在基线前三个月内使用隐形眼镜或任何眼科手术程序。 此外，排除了具有单个功能性眼睛，怀孕或母乳喂养的受试者，以及有未经避孕的妊娠风险的受试者。

在治疗启动后，在给药之前（V1）和4周（V2）和12周（V3）收集临床数据和OS样品（图1A）。 在V1的50名参与者中，每个小组的21名参与者完成了V2的随访，而CSA组的14名参与者和Newhyaluni组的18名参与者保留在V3。使用无菌混合纤维素酯（MCF）膜（Millipore，Merck）从下结膜囊中获得微生物组分析的OS样品。 从CSA组的13名参与者和Newhyaluni组的13名参与者收集了OS样本。 将所有OS样品存储在-80°C，直到提取DNA进行微生物组分析。

使用眼表面疾病指数（OSDI），视觉模拟量表（VAS）以及改良的标准患者眼干评估（速度）问卷评估临床数据收集症状。 通过测量泪液破裂时间（TBUT）来评估泪膜稳定性。 通过将一滴无菌盐水涂在无菌荧光素条上，进行角膜的荧光素染色。 在受试者自然眨眼3次之后，记录了正常的眨眼和在泪膜中首次出现干点之间的时间。 三个重复测量的平均值用于分析。

使用根据牛津评分系统分级的荧光素染色评分（FSS）评估OS炎症（50）。 Meibomian腺体和眼睑炎症的严重程度以及盖缘充血性高血症的评分为无，轻度，中度或严重。 使用没有麻醉的Schirmer带测量泪液分泌。 在下眼睑的下眼睑的三分之一，下骨结膜和下部鳞茎结膜之间放置一个schirmer条。 5分钟后，以毫米为单位测量了条带吸收的泪液的长度。

使用Rneasy Powermicrobiome套件（Qiagen，Inc.，Valencia，CA，美国）从收集的OS样品中提取DNA提取和整个元基因组测序总DNA。 使用μCuvetteG1.0（Eppendorf，Eppendorf，汉堡，德国）用生物光计D30测量DNA浓度。 为了消除在实验过程中的潜在污染物，包括12个阴性对照，包括采样膜，无DNA的水添加到DNA提取试剂盒中，以及在测序文库制备试剂盒中添加的无DNA水。 这些阴性对照与61个OS样品一起测序。

对于整个元基因组测序，使用nebnext dsDNA片段（新英格兰Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA）将提取的DNA分散。 根据制造商的协议，使用Swift 2S Turbo DNA图书馆试剂盒（Swift Biosciences，Inc。）进行图书馆准备。 使用Hiaccubead（Accugene，San Diego，CA，美国）进行纯化和尺寸选择。 使用Swift 2S涡轮组合双索引底漆试剂盒（Swift Biosciences，Inc。）进行索引PCR，然后使用HiAccubead进行额外的纯化和尺寸选择。 使用Qubit™DSDNA HS分析套件（美国Thermo Fisher Scientific，美国）对每个样品的库浓度进行定量。 将每个库的等摩尔浓度（4nm）合并，并在Illumina Novaseq 6000系统（250 bp配对的端）上进行测序。

如前所述（51，52）处理从Novaseq系统获得的原始序列数据。 修剪适配器序列，并使用Trimmomatic（53）进行质量过滤。 使用Pear V.0.9.11（54）合并配对末端序列。 使用参考人基因组的BBMAP鉴定并去除了元基因组数据中的人类衍生序列。 分类单元