Rôle potentiel du microbiome de surface oculaire dans la sécheresse oculaire: interactions microbiennes et atténuation des symptômes

Conception de l'étude et collecte d'échantillons Cette étude est randomisée, en double aveugle et essai prospectif. Les critères d'inclusion étaient les suivants: les patients âgés de 19 ans ou plus avec des symptômes de syndrome de l'œil sécheux. Au total, 50 participants ont été assignés au hasard au groupe CSA (n = 25, cyclosporine deux fois par jour et acide hyaluronique deux fois par jour) ou le groupe témoin (n = 25, acide hyaluronique quatre fois par jour). 0,05% de cyclosporine A (cyporine n gouttes oculaires, Taejoon Pharm, République de Corée) et 0,15% d'acide hyaluronique (New Hyaluni Eye Grops, Taejoon Pharm) ont été utilisés dans cette étude. L'aveuglement a été maintenu en séparant l'examinateur et le collecteur d'échantillons.

Les critères d'exclusion comprenaient l'utilisation de gouttes oculaires topiques ou de médicaments systémiques (tels que des stéroïdes systémiques, des immunomodulateurs et des tétracyclines) qui pourraient influencer les résultats de l'étude, ainsi que la présence de conjonctivite, une blépharite antérieure, une infestation de dénomination, une infection oculaire parasit Kératoplastie, utilisation des lentilles de contact ou toute procédure chirurgicale ophtalmique dans les trois mois précédant la ligne de base. De plus, les sujets ayant une seule œil fonctionnelle, des femmes enceintes ou allaités, et ceux qui risquent de grossesse sans contraception ont été exclus.

Les données cliniques et les échantillons de SG ont été prélevés au départ avant l'administration des chutes oculaires (V1) et à 4 semaines (V2) et 12 semaines (V3) après le début du traitement (Fig. 1A). Sur les 50 participants de la V1, 21 participants de chaque groupe ont effectué un suivi à V2, tandis que 14 participants au groupe CSA et 18 participants du groupe Newhyaluni sont restés à V3. Des échantillons de SG pour l'analyse du microbiome ont été obtenus à partir du SAC conjonctival inférieur en utilisant une membrane à ester de cellulose mixte stérile (MCF) (Millipore, Merck). Les échantillons de SG ont été prélevés auprès de 13 participants du groupe CSA et de 13 participants au groupe Newhyaluni. Tous les échantillons de SG ont été stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ADN pour l'analyse du microbiome.

Les symptômes de collecte de données cliniques ont été évalués à l'aide de l'indice de maladie de surface oculaire (OSDI), de l'échelle visuelle analogique (EVA) pour la douleur et du questionnaire modifié de l'évaluation standard du patient de la sécheresse oculaire (vitesse). La stabilité du film lacrymal a été évaluée en mesurant le temps de rupture des larmes (TBUT). La coloration de la fluorescéine de la cornée a été effectuée en appliquant une goutte de solution saline stérile sur une bande de fluorescéine stérile. Après que le sujet ait cligné des yeux naturellement trois fois, le temps entre un clin d'œil normal et la première apparition d'une tache sèche dans le film lacrymal a été enregistré. La moyenne de trois mesures répétées a été utilisée pour l'analyse.

L'inflammation des SG a été évaluée en utilisant le score de coloration de la fluorescéine (FSS) classée selon le système de notation d'Oxford (50). La gravité des glandes méibomiennes et de l'inflammation des paupières, ainsi que l'hyperémie des marges de couvercle, ont été classées comme aucune, légères, modérées ou sévères. La sécrétion de larmes a été mesurée à l'aide de la bande de Schirmer sans anesthésie. Une bande de Schirmer a été placée au tiers temporel de la paupière inférieure, entre la conjonctiva palpébrale inférieure et la conjonctiva bulbaire inférieur. Après 5 min, la longueur du liquide lacrymal absorbé par la bande a été mesurée en millimètres.

L'extraction d'ADN et le séquençage du métagénome entier ADN total ont été extraits des échantillons de SG collectés en utilisant le kit RNEASY PowerMicrobiome (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). La concentration d'ADN a été mesurée avec un biophotomètre D30 en utilisant une μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hambourg, Allemagne). Pour éliminer les contaminants potentiels pendant le processus expérimental, 12 contrôles négatifs ont été inclus, comprenant des membranes d'échantillonnage, de l'eau sans ADN ajoutée au kit d'extraction d'ADN et de l'eau sans ADN ajoutée au kit de préparation de la bibliothèque de séquençage. Ces témoins négatifs ont été séquencés à côté des 61 échantillons de SG.

Pour le séquençage du métagénome entier, l'ADN extrait a été fragmenté en utilisant NEBNEXT DSDNA fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). La préparation de la bibliothèque a été effectuée avec un kit de bibliothèque Swift 2S Turbo ADN (Swift Biosciences, Inc., USA) suivant le protocole du fabricant. La purification et la sélection de taille ont été réalisées à l'aide de Hiacubead (Accugene, San Diego, CA, USA). La PCR de l'index a été réalisée avec le kit d'amorce à double indexation Turbo Swift 2S 2S (Swift Biosciences, Inc.), suivi d'une purification et d'une sélection de taille supplémentaires à l'aide de Hiacubead. La concentration de bibliothèque pour chaque échantillon a été quantifiée à l'aide du kit de dosage DSDNA HS Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific, USA). Les concentrations équimolaires de chaque bibliothèque (4 nm) ont été regroupées et séquencées sur un système Illumina Novaseq 6000 (extrémité appariée de 250 pb).

Les données de séquence brutes obtenues à partir du système Novaseq ont été traitées comme décrit précédemment (51, 52). Les séquences d'adaptateur ont été coupées et le filtrage de qualité a été effectué en utilisant un trimmomatique (53). Les séquences à extrémité appariée ont été fusionnées à l'aide de Pear V.0.9.11 (54). Des séquences dérivées de l'homme dans les données du métagénome ont été identifiées et supprimées à l'aide de BBMAP avec un génome humain de référence. Taxon