Potenciální role očního povrchu mikrobiomu v suchém oku: mikrobiální interakce a zmírnění příznaků

Návrh studie a sběr vzorků Tato studie je randomizovaná, dvojitě slepá a prospektivní studie. Kritéria pro zařazení byla následující: pacienti ve věku 19 let a starších s příznaky syndromu suchého oka. Celkem 50 účastníků bylo náhodně přiřazeno buď ke skupině CSA (n = 25, cyklosporin A dvakrát denně a kyselina hyaluronová dvakrát denně) nebo kontrolní skupině (n = 25, kyselina hyaluronová čtyřikrát denně). V této studii bylo použito 0,05% cyklosporin A (Cyporin N Eye Drops, Taejoon Pharm, Korejská republika) a 0,15% kyseliny hyaluronové (nové oční kapky Hyaluni, Taejoon Pharm). Oslepení bylo udržováno oddělením zkoušejícího a sběratele vzorků.

Kritéria pro vyloučení zahrnovala použití lokálních očních kapek nebo systémových léků (jako jsou systémové steroidy, imunomodulátory a tetracykliny), které by mohly ovlivnit výsledky studie, jakož i přítomnost spojivky, předním blefaritidou, neresolutiva okulárního okulárního okulárního poruchy, a historie peretrujícího koretora, peraturní koretizující peraturní oční infest. Kontaktní čočky nebo jakýkoli oftalmický chirurgický zákrok do tří měsíců před výchozím hodnotou. Kromě toho byly vyloučeny subjekty s jediným funkčním okem, těhotným nebo kojením žen a ty, které jsou ohroženy těhotenstvím bez antikoncepce.

Klinické údaje a vzorky OS byly odebrány na začátku před podáváním očí (V1) a po 4 týdnech (V2) a 12 týdnů (V3) po zahájení léčby (obr. 1A). Z 50 účastníků ve V1 21 účastníků z každé skupiny dokončilo sledování na V2, zatímco 14 účastníků ve skupině CSA a 18 účastníků ve skupině Newhyaluni zůstalo ve V3. Vzorky OS pro analýzu mikrobiomu byly získány z dolního spojovacího vaku s použitím membrány sterilní smíšené celulózy (MCF) (Millipore, Merck). Vzorky OS byly odebrány od 13 účastníků skupiny CSA a 13 účastníků ve skupině Newhyaluni. Všechny vzorky OS byly skladovány při -80 ° C až do extrakce DNA pro analýzu mikrobiomu.

Příznaky sběru klinických dat byly hodnoceny pomocí indexu očního povrchového onemocnění (OSDI), vizuální analogové stupnice (VAS) pro bolest a modifikované standardní hodnocení dotazníku o očí (rychlostí) pacienta. Stabilita slzného filmu byla vyhodnocena měřením doby rozpadu slzy (TBUT). Fluoresceinové barvení rohovky bylo provedeno použitím kapky sterilního solného roztoku na sterilní fluoresceinový pás. Poté, co subjekt přirozeně třikrát zamrkal, byl zaznamenán čas mezi normálním mrknutím a prvním vzhledem suchého místa v slzném filmu. Pro analýzu byl použit průměr tří opakovaných měření.

Zánět OS byl hodnocen pomocí skóre barvení fluoresceinu (FSS) tříděného podle systému Oxford bodování (50). Závažnost meibomických žláz a zánětů očních víček, jakož i hyperémie okraje víka, byla hodnocena jako žádná, mírná, střední nebo těžká. Sekrece slzy byla měřena pomocí Schirmerova proužku bez anestézie. Schirmerový pás byl umístěn na dočasnou třetinu spodního víčka, mezi spodní palpebrální spojivkou a spodní konjunktiva dolního bulbaru. Po 5 minutách byla měřena délka slzné tekutiny absorbované proužkem v milimetrech.

Extrakce DNA a celé metagenomové sekvenování celkové DNA byla extrahována ze shromážděných vzorků OS pomocí soupravy RNEASY PowerMicrobiom (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). Koncentrace DNA byla měřena biofotometrem D30 pomocí μCUvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Německo). Pro eliminaci potenciálních kontaminantů během experimentálního procesu bylo zahrnuto 12 negativních kontrol, které obsahovaly vzorkovací membrány, voda bez DNA přidaná do extrakční soupravy DNA a voda bez DNA přidala do sekvenční přípravy knihovny. Tyto negativní kontroly byly sekvenovány podél vzorků 61 OS.

Pro celé metagenomové sekvenování byla extrahovaná DNA fragmentována pomocí nebnext dsDNA fragmentázy (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Příprava knihovny byla provedena se sadou knihovny Swift 2S Turbo DNA (Swift Biosciences, Inc., USA) podle protokolu výrobce. Čištění a výběr velikosti byly prováděny pomocí HiacCubead (Accugene, San Diego, CA, USA). Index PCR byl prováděn pomocí soupravy primerů SWIFT 2S Turbo Combinatoratorial Dual Indexing (Swift Biosciences, Inc.), následovanou dalším čištění a výběrem velikosti pomocí HiacCubead. Koncentrace knihovny pro každý vzorek byla kvantifikována pomocí soupravy pro testovací soupravu Qubit ™ DSDNA HS (Thermo Fisher Scientific, USA). Ekvimolární koncentrace každé knihovny (4nm) byly spojeny a sekvenovány na systému Illumina Novaseq 6000 (250 bp párově konec).

Nezpracovaná sekvenční data získaná ze systému Novaseq byla zpracována, jak bylo popsáno dříve (51, 52). Sekvence adaptérů byly oříznuty a filtrování kvality bylo provedeno pomocí Trimmomatic (53). Sekvence párového konce byly sloučeny pomocí hrušky V.0.9.11 (54). Sekvence odvozené od člověka v metagenomových datech byly identifikovány a odstraněny pomocí BBMAP s referenčním lidským genomem. Taxon