Potentiell roll för okulär ytmikrobiom i torrt öga: Mikrobiella interaktioner och symptominställning

Studiedesign och provsamling Denna studie är randomiserad, dubbelblind och prospektiv studie. Inkluderingskriterierna var som följer: patienter i åldern 19 år eller äldre med symtom på torrt ögonsyndrom. Totalt tilldelades 50 deltagare slumpmässigt till antingen CSA -gruppen (n = 25, cyklosporin en två gånger om dagen och hyaluronsyra två gånger dagligen) eller kontrollgruppen (n = 25, hyaluronsyra fyra gånger dagligen). 0,05% cyklosporin A (Cyporin N ögondroppar, Taejoon Pharm, Republic of Korea) och 0,15% hyaluronsyra (nya hyaluni -ögondroppar, Taejoon Pharm) användes i denna studie. Blandning bibehölls genom att separera undersökaren och provsamlaren.

Exclusion criteria included the use of topical ocular drops or systemic medication (such as systemic steroids, immunomodulators, and tetracyclines) that could influence study outcomes, as well as the presence of conjunctivitis, anterior blepharitis, Demodex infestation, parasitic eye infections, unresolved ocular trauma, healing disorders of the OS, a history of penetrating keratoplasty, contact lens Användning eller något oftalmiskt kirurgiskt ingrepp inom tre månader före baslinjen. Dessutom utesluts försökspersoner med ett enda funktionellt öga, gravida eller ammande kvinnor och de som riskerar att graviditet utan preventivmedel.

Kliniska data och OS -prover samlades vid baslinjen före ögondroppadministration (V1) och vid 4 veckor (V2) och 12 veckor (V3) efter behandlingsinitiering (fig. 1A). Av de 50 deltagarna på V1 slutförde 21 deltagare från varje grupp uppföljning på V2, medan 14 deltagare i CSA-gruppen och 18 deltagare i Newhyaluni-gruppen förblev på V3. OS -prover för mikrobiomanalys erhölls från den underordnade konjunktivala SAC med användning av steril blandad cellulosaester (MCF) -membran (Millipore, Merck). OS -prover samlades in från 13 deltagare i CSA -gruppen och 13 deltagare i Newhyaluni -gruppen. Alla OS -prover lagrades vid -80 ° C tills DNA -extraktion för mikrobiomalys.

Symtom för klinisk datainsamling utvärderades med användning av Ocular Surface Disease Index (OSDI), Visual Analogue Scale (VAS) för smärta och den modifierade standardpatientutvärderingen av Eye Dryness (Speed) -frågeformuläret. Tårfilmstabilitet utvärderades genom att mäta tåravbrottstiden (TBUT). Fluoresceinfärgning av hornhinnan utfördes genom applicering av en droppe steril saltlösning på en steril fluoresceinremsa. Efter att ämnet blinkade naturligt tre gånger, spelades tiden mellan en normal blinkning och det första utseendet på en torr plats i tårfilmen. Genomsnittet av tre upprepade mätningar användes för analys.

OS -inflammation utvärderades med användning av Fluorescein -färgningsscore (FSS) graderad enligt Oxford -poängsystemet (50). Svårighetsgraden av meibomianska körtlar och ögonlocksinflammation, såväl som lockmarginalhyperemi, graderades som ingen, mild, måttlig eller svår. Tårutsöndring mättes med hjälp av Schirmer -remsan utan anestesi. En Schirmer -remsa placerades vid den temporära tredjedelen av det nedre ögonlocket, mellan den nedre palpebral konjunktiva och den nedre bulbar konjunktiva. Efter 5 minuter mättes längden på tårvätskan som absorberades av remsan i millimeter.

DNA -extraktion och hel metagenomsekvensering Totalt DNA extraherades från de insamlade OS -proverna med användning av RNeasy PowerMicrobiom -kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). DNA -koncentration mättes med en biofotometer D30 med användning av en μcuvett G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). För att eliminera potentiella föroreningar under den experimentella processen inkluderades 12 negativa kontroller, innefattande provtagningsmembran, DNA-fritt vatten tillsatt till DNA-extraktionssatsen och DNA-fritt vatten tillsattes till sekvenseringsbibliotekets beredningssats. Dessa negativa kontroller sekvenserades tillsammans med 61 OS -prover.

För hela metagenom -sekvensering fragmenterades DNA med användning av nebnext dsDNA -fragmentas (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Biblioteksförberedelser utfördes med ett Swift 2S Turbo DNA -bibliotekssats (Swift Biosciences, Inc., USA) efter tillverkarens protokoll. Rening och selektion av storlek genomfördes med användning av Hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA). Index PCR utfördes med Swift 2S Turbo Combinatorial Dual Indexing Primer Kit (Swift Biosciences, Inc.), följt av ytterligare rening och storleksval med Hiaccubead. Bibliotekskoncentrationen för varje prov kvantifierades med användning av Qubit ™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Ekvimolära koncentrationer av varje bibliotek (4NM) slogs samman och sekvenserades på ett Illumina Novaseq 6000-system (250-bp parat ände).

Rå sekvensdata erhållna från Novaseq -systemet behandlades såsom tidigare beskrivits (51, 52). Adaptersekvenser trimmades och kvalitetsfiltrering utfördes med användning av trimmomatisk (53). Parade slutsekvenser slogs samman med Pear V.0.9.11 (54). Mänskliga härledda sekvenser i metagenomdata identifierades och avlägsnades med användning av BBMAP med ett referens mänskligt genom. Taxon