Potentiel rolle af okulær overflademikrobiom i tørt øje: Mikrobielle interaktioner og symptomlindring

Undersøgelsesdesign og prøvekollektion Denne undersøgelse er randomiseret, dobbeltblind og potentiel prøve. Inkluderingskriterierne var som følger: Patienter i alderen 19 år eller ældre med symptomer på tørt øjensyndrom. I alt 50 deltagere blev tilfældigt tildelt enten CSA -gruppen (n = 25, cyclosporin A to gange om dagen og hyaluronsyre to gange dagligt) eller kontrolgruppen (n = 25, hyaluronsyre fire gange dagligt). 0,05% cyclosporin A (Cyporin N øjendråber, Taejoon Pharm, Republic of Korea) og 0,15% hyaluronsyre (nye hyaluni -øjendråber, Taejoon Pharm) blev anvendt i denne undersøgelse. Blinding blev opretholdt ved at adskille eksaminatoren og prøveopsamleren.

Exclusion criteria included the use of topical ocular drops or systemic medication (such as systemic steroids, immunomodulators, and tetracyclines) that could influence study outcomes, as well as the presence of conjunctivitis, anterior blepharitis, Demodex infestation, parasitic eye infections, unresolved ocular trauma, healing disorders of the OS, a history of penetrating Keratoplastik, brug af kontaktlinse eller enhver oftalmisk kirurgisk procedure inden for tre måneder før baseline. Derudover blev forsøgspersoner med et enkelt funktionelt øje, gravide eller ammende kvinder, og dem, der var i fare for graviditet uden prævention, udelukket.

Kliniske data og OS -prøver blev indsamlet ved baseline før øjendråbeadministration (V1) og ved 4 uger (V2) og 12 uger (V3) efter behandlingsinitiering (fig. 1A). Af de 50 deltagere på V1 afsluttede 21 deltagere fra hver gruppe opfølgning på V2, mens 14 deltagere i CSA-gruppen og 18 deltagere i Newhyaluni-gruppen forblev på V3. OS -prøver til mikrobiomanalyse blev opnået fra den underordnede konjunktival SAC under anvendelse af steril blandet celluloseester (MCF) membran (Millipore, Merck). OS -prøver blev indsamlet fra 13 deltagere i CSA -gruppen og 13 deltagere i Newhyaluni -gruppen. Alle OS -prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil DNA -ekstraktion til mikrobiomanalyse.

Kliniske dataindsamlingssymptomer blev vurderet ved anvendelse af Ocular Surface Disease Index (OSDI), visuel analog skala (VAS) for smerter og den modificerede standardpatientevaluering af spørgeskemaet for øje tørhed (hastighed). Tårfilmstabilitet blev evalueret ved at måle tåreopbrudstiden (TBUT). Fluoresceinfarvning af hornhinden blev udført ved at anvende en dråbe steril saltvand på en steril fluoresceinstrimmel. Efter at emnet blinkede naturligt tre gange, blev tiden mellem en normal blink og den første optræden af ​​et tørt sted i tårefilmen optaget. Gennemsnittet af tre gentagne målinger blev anvendt til analyse.

OS -betændelse blev vurderet ved anvendelse af fluoresceinfarvningsscore (FSS) klassificeret i henhold til Oxford -scoringssystemet (50). Alvorligheden af ​​meibomiske kirtler og øjenlågsinflammation såvel som lågmarginhyperæmi blev klassificeret som ingen, mild, moderat eller alvorlig. Tåresekretion blev målt under anvendelse af Schirmer -strimlen uden anæstesi. En Schirmer -strimmel blev anbragt ved den temporale tredjedel af det nedre øjenlåg, mellem den nedre palpebrale konjunktiva og den nedre bulbar -konjunktiva. Efter 5 minutter blev længden af ​​tårevæske, der blev absorberet af strimlen, målt i millimeter.

DNA -ekstraktion og hele metagenom -sekventering af total DNA blev ekstraheret fra de indsamlede OS -prøver under anvendelse af RNeasy Powermicrobiome Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). DNA -koncentration blev målt med et biofotometer D30 under anvendelse af en μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). For at eliminere potentielle forurenende stoffer under den eksperimentelle proces blev 12 negative kontroller inkluderet, omfattende prøveudtagningsmembraner, DNA-fri vand tilsat til DNA-ekstraktionssættet og DNA-fri vand tilsat til sekventeringsbibliotekets forberedelsessæt. Disse negative kontroller blev sekventeret ved siden af ​​61 OS -prøverne.

Til hel metagenom -sekventering blev ekstraheret DNA fragmenteret under anvendelse af nebNext dsDNA -fragmentase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Bibliotekforberedelse blev udført med et Swift 2S Turbo DNA Library Kit (Swift Biosciences, Inc., USA) efter producentens protokol. Oprensning og valg af størrelse blev udført under anvendelse af hiaccubead (Accugene, San Diego, CA, USA). Indeks PCR blev udført med SWIFT 2S Turbo Combinatorial Dual Indexing Primer Kit (Swift Biosciences, Inc.), efterfulgt af yderligere rensning og størrelse valg ved hjælp af Hiaccubead. Bibliotekskoncentrationen for hver prøve blev kvantificeret ved anvendelse af Qubit ™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Equimolære koncentrationer af hvert bibliotek (4NM) blev samlet og sekventeret på et Illumina Novaseq 6000-system (250 bp parret ende).

Rå sekvensdata opnået fra Novaseq -systemet blev behandlet som tidligere beskrevet (51, 52). Adaptersekvenser blev trimmet, og kvalitetsfiltrering blev udført under anvendelse af trimmomatisk (53). Parret ende sekvenser blev fusioneret under anvendelse af Pear V.0.9.11 (54). Human-afledte sekvenser i metagenomdataene blev identificeret og fjernet under anvendelse af BBMAP med et reference humant genom. Taxon