Silmän pinnan mikrobiomin mahdollinen rooli kuivassa silmässä: mikrobien vuorovaikutukset ja oireiden lievittäminen

Tutkimuksen suunnittelu ja näytteenkeruu Tämä tutkimus on satunnaistettu, kaksoissokkoutettu ja tulevaisuuden tutkimus. Sisällyttämiskriteerit olivat seuraavat: 19 -vuotiaat tai sitä vanhemmat potilaat, joilla oli oireita kuiva -silmien oireyhtymästä. Yhteensä 50 osallistujaa jaettiin satunnaisesti joko CSA -ryhmälle (n = 25, syklosporiini A kahdesti päivässä ja hyaluronihappo kahdesti päivässä) tai kontrolliryhmälle (n = 25, hyaluronihappo neljä kertaa päivässä). Tässä tutkimuksessa käytettiin 0,05% syklosporiini A (Cyparin N -silmätippoja, Taejoon Pharm, Korean tasavalta) ja 0,15% hyaluronihappoa (uusia Hyaluni -silmätippoja). Sokeutta ylläpidettiin erottamalla tutkija ja näytteenkeräin.

Poissulkemiskriteerit sisälsivät ajankohtaisten silmäpisarien tai systeemisten lääkkeiden (kuten systeemisten steroidien, immunomodulaattorien ja tetrasykliinien) käyttöä, jotka voivat vaikuttaa tutkimuksen tuloksiin, samoin kuin sidekalvotulehduksen, etulevyn etuosan, demodexin tartunnan, loisten silmäinfektioiden, lievään ocular trauman, parannushäiriöiden parannushäiriöiden, a. Keratoplastia, piilolinssien käyttö tai kaikki oftalminen kirurginen toimenpide kolmen kuukauden kuluessa ennen lähtötasoa. Lisäksi koehenkilöt, joilla oli yksi funktionaalinen silmä, raskaana olevia tai imettäviä naisia, ja raskauden riski ilman ehkäisyä jätettiin pois.

Kliiniset tiedot ja OS -näytteet kerättiin lähtötilanteessa ennen silmien pudotusta (V1) ja 4 viikossa (V2) ja 12 viikkoa (V3) hoidon aloittamisen jälkeen (kuva 1A). V1: n 50 osallistujasta 21 osallistujaa jokaisen ryhmän seurannassa suoritti V2: n seurannan, kun taas 14 CSA-ryhmän osallistujaa ja Newhyaluni-ryhmän 18 osallistujaa pysyivät V3: lla. OS -näytteet mikrobiomianalyysiä varten saatiin ala -arvoisesta sidekalvopussista käyttämällä steriiliä sekoitettuja selluloosaesteriä (MCF) membraania (Millipore, Merck). OS -näytteet kerättiin 13 CSA -ryhmän osallistujalta ja 13 Newhyaluni -ryhmän osallistujalta. Kaikki OS -näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes DNA -uutto on mikrobiomianalyysiä.

Kliinisen tiedonkeruun oireet arvioitiin käyttämällä silmän pintatauti -indeksiä (OSDI), visuaalista analogista asteikkoa (VAS) kipuun ja silmien kuivumisen (nopeuden) kyselylomakkeen modifioidun potilaan arvioinnin. Kyynelkalvon vakaus arvioitiin mittaamalla kyynelten hajoamisaika (TBUT). Sarveiskalvon fluoreseiinivärjäys suoritettiin levittämällä tippa steriiliä suolaliuosta steriilille fluoreseiininauhalle. Kun kohde vilkkuu luonnollisesti kolme kertaa, tavanomaisen vilkkumisen ja kyynelkalvon ensimmäisen esiintymisen välinen aika nauhoitettiin. Analyysiin käytettiin kolmen toistuvan mittauksen keskiarvoa.

OS -tulehdukset arvioitiin käyttämällä Oxfordin pisteytysjärjestelmän (50) mukaan Fluoreseiinin värjäyspistettä (FSS). Meibomian rauhasten ja silmäluomen tulehduksen sekä kannen marginaalin hyperemian vakavuus luokiteltiin yhtään, lievää, kohtalaista tai vakavaa. Kyyneljärynten eritys mitattiin Schirmer -nauhalla ilman anestesiaa. Schirmer -nauha asetettiin alemman silmäluomen ajalliseen kolmannekseen, alemman palpebral -sidekalvon ja alemman bulbar -sidekalvojen väliin. 5 minuutin kuluttua nauhan absorboiman kyynelnesteen pituus mitattiin millimetreinä.

DNA: n uutto ja koko metagenomin sekvensointi kokonais -DNA uutettiin kerätyistä OS -näytteistä käyttämällä RNeasy Powermikrobiome -sarjaa (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). DNA -konsentraatio mitattiin biofotometrillä D30 käyttämällä μcuvette G1.0: ta (Eppendorf, Hampuri, Saksa). Mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi kokeellisen prosessin aikana sisällytettiin 12 negatiivista kontrollia, jotka sisälsivät näytteenottokalvoja, DNA-uuttopakkaukseen lisättyjä DNA-vapaat vedet ja sekvensointikirjaston valmistuspakkaukseen lisätyn DNA-vapaan veden. Nämä negatiiviset kontrollit sekvensoitiin 61 OS -näytteen rinnalle.

Koko metagenomisekvensointia varten uutettu DNA fragmentoitiin käyttämällä Nebnext -dsDNA -fragmentaasia (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Kirjaston valmistelu suoritettiin Swift 2s Turbo DNA -kirjastopaketilla (Swift Biosciences, Inc., USA) valmistajan protokollan jälkeen. Puhdistus ja kokovalinta suoritettiin käyttämällä Hiaccubeadia (Accugene, San Diego, CA, USA). Hakemisto PCR suoritettiin Swift 2s Turbo -yhdistelmän kaksois -indeksointikarjan (Swift Biosciences, Inc.) kanssa, jota seurasi lisäpuhdistus ja kokovalinta HIACCUBeadilla. Kunkin näytteen kirjastopitoisuus kvantifioitiin käyttämällä Qubit ™ dsDNA HS -määrityspakkausta (Thermo Fisher Scientific, USA). Kunkin kirjaston ekvimolaariset pitoisuudet (4Nm) yhdistettiin ja sekvensoitiin Illumina Novaseq 6000 -järjestelmään (250 bp parillinen pää).

Novaseq -järjestelmästä saadut raa'at sekvenssitiedot prosessoitiin aiemmin kuvatulla tavalla (51, 52). Adapterisekvenssit leikattiin ja laadun suodatus suoritettiin trimmomaattisesti (53). Parillisen pään sekvenssit yhdistettiin käyttämällä Pear V.0.9.11 (54). Ihmisen peräisin olevat sekvenssit metagenomitiedoissa tunnistettiin ja poistettiin käyttämällä BBMAP: ta vertailun ihmisen genomilla. Taksoni