Panario potencial del microbioma de la superficie ocular en el ojo seco: interacciones microbianas y alivio de los síntomas

Diseño del estudio y recolección de muestras Este estudio es aleatorizado, doble ciego y ensayo prospectivo. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: pacientes de 19 años o más con síntomas de síndrome de ojo seco. Un total de 50 participantes fueron asignados aleatoriamente al grupo CSA (n = 25, ciclosporina a dos veces al día y ácido hialurónico dos veces al día) o al grupo de control (n = 25, ácido hialurónico cuatro veces al día). El 0.05% de ciclosporina A (Cyporin N Eye Drops, TaJoon Pharm, República de Corea) y 0.15% de ácido hialurónico (nuevas gotas de ojos Hyaluni, TaJoon Pharm) en este estudio. El cegamiento se mantuvo separando el examinador y el colector de muestras.

Los criterios de exclusión incluyeron el uso de gotas oculares tópicas o medicamentos sistémicos (como esteroides sistémicos, inmunomoduladores y tetraciclinas) que podrían influir Uso de lentes de contacto o cualquier procedimiento quirúrgico oftálmico dentro de los tres meses anteriores a la línea de base. Además, los sujetos con un solo ojo funcional, embarazadas o amamantadas, y aquellos en riesgo de embarazo sin anticoncepción fueron excluidos.

Los datos clínicos y las muestras de OS se recopilaron al inicio antes de la administración de gotas oculares (V1) y a las 4 semanas (V2) y 12 semanas (V3) después del inicio del tratamiento (Fig. 1A). De los 50 participantes en V1, 21 participantes de cada grupo completaron el seguimiento en V2, mientras que 14 participantes en el grupo CSA y 18 participantes en el grupo Newhyaluni permanecieron en V3. Las muestras de OS para el análisis del microbioma se obtuvieron del saco conjuntival inferior usando membrana de éster de celulosa mixta estéril (MCF) (Millipore, Merck). Se recolectaron muestras de OS de 13 participantes en el grupo CSA y 13 participantes en el grupo Newhyaluni. Todas las muestras de OS se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ADN para el análisis del microbioma.

Los síntomas de recopilación de datos clínicos se evaluaron utilizando el índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI), la escala analógica visual (VAS) para el dolor y el cuestionario modificado de evaluación estándar del paciente de la sequedad ocular (velocidad). La estabilidad de la película lagrimal se evaluó midiendo el tiempo de ruptura de la lágrima (TBUT). La tinción de fluoresceína de la córnea se realizó aplicando una gota de solución salina estéril a una tira de fluoresceína estéril. Después de que el sujeto parpadeó naturalmente tres veces, se grabó el tiempo entre un parpadeo normal y la primera aparición de un lugar seco en la película lagrimal. El promedio de tres mediciones repetidas se utilizó para el análisis.

La inflamación del sistema operativo se evaluó utilizando la puntuación de tinción de fluoresceína (FSS) graduada de acuerdo con el sistema de puntuación de Oxford (50). La gravedad de las glándulas meibomianas y la inflamación del párpado, así como la hiperemia del margen de la tapa, se calificó como ninguno, leve, moderado o severo. La secreción de lágrimas se midió utilizando la tira de Schirmer sin anestesia. Se colocó una tira de Schirmer en el tercio temporal del párpado inferior, entre la conjuntiva palpebral inferior y la conjuntiva bulbar inferior. Después de 5 minutos, la longitud del fluido lagrimal absorbido por la tira se midió en milímetros.

La extracción de ADN y la secuenciación de metagenoma completo se extrajeron el ADN total de las muestras de OS recolectadas utilizando el kit RNeasy Powermicrobiome (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EE. UU.). La concentración de ADN se midió con un biofotómetro D30 usando una μcuvette G1.0 (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Para eliminar los contaminantes potenciales durante el proceso experimental, se incluyeron 12 controles negativos, que comprenden membranas de muestreo, agua sin ADN agregada al kit de extracción de ADN y agua sin ADN agregada al kit de preparación de la biblioteca de secuenciación. Estos controles negativos se secuenciaron junto con las 61 muestras de OS.

Para la secuenciación de metagenoma completo, el ADN extraído se fragmentó usando fragmentasa de dsDNA de Nebnext (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, EE. UU.). La preparación de la biblioteca se realizó con un kit de biblioteca de ADN Turbo Swift 2S (Swift Biosciences, Inc., EE. UU.) Siguiendo el protocolo del fabricante. La purificación y la selección de tamaño se realizaron utilizando HiacCubead (Accugene, San Diego, CA, EE. UU.). El índice PCR se llevó a cabo con el kit de cebador de indexación dual turbo combinatorial Swift 2S (Swift Biosciences, Inc.), seguido de purificación adicional y selección de tamaño utilizando HiacCubead. La concentración de la biblioteca para cada muestra se cuantificó utilizando el kit de ensayo QBIT ™ DSDNA HS (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las concentraciones equimolares de cada biblioteca (4 nm) se agruparon y secuenciaron en un sistema Illumina Novaseq 6000 (extremo emparejado de 250 pb).

Los datos de secuencia sin procesar obtenidos del sistema NovaseQ se procesaron como se describió anteriormente (51, 52). Las secuencias del adaptador se recortaron y el filtrado de calidad se realizó usando trimmomático (53). Las secuencias de extremo emparejado se fusionaron usando Pear V.0.9.11 (54). Las secuencias derivadas de humanos en los datos del metagenoma se identificaron y eliminaron usando BBMAP con un genoma humano de referencia. Taxón