PMPRとクロルヘキシジンによる歯周病と血管機能への影響 (CHX-PMPR-PERIV)

アーム2 - このアームの参加者は、ルーチンケアの一環として、ベースライン（訪問1）で超音波スケーラーを使用したPMPRを受けます。 訪問2（1日目）では、参加者はクロルヘキシジン洗口液と味、色、外観が同一のプラセボ洗口液を投与されるよう無作為化されます。

- このプラセボ対照により、参加者と研究者を盲検化したまま、クロルヘキシジンと活性抗菌治療なしの効果を評価することができます。 参加者は同じレジメン（10mlのうがい、1分間、1日2回、14日間）を遵守し、唾液、AEP、血液、血管機能の測定をベースライン、1日目、14日目、90日目に収集します。

• アーム1
• このアームの参加者は、標準治療の一環として、ベースライン（訪問1）で超音波スケーラーを使用したPMPRを受けます。 訪問2（1日目）では、0.2％クロルヘキシジン洗口液（10ml、1分間、1日2回、14日間）を無作為に割り当てられ、唾液、獲得エナメルペリクル（AEP）、血液サンプルの採取、および血管機能測定がベースライン（0日目）、1日目、14日目、および90日目に行われます。

• クロルヘキシジンマウスウォッシュ

目的：炎症性および保護性タンパク質を同定し、唾液におけるPMPR後の変化をモニタリングすること。

• 方法（ロンドンのインペリアル・カレッジからのプロトコル）：
• 還元およびアルキル化：唾液の10μLアリコートを解凍し、氷上で7μLの炭酸水素アンモニウム緩衝液と混合する。 還元およびアルキル化のために、それぞれ5μLのTCEPとCAAを添加し、pH 7-8を維持してジスルフィド結合およびシステイン残基の適切な修飾を確保する。
• SP4プロトコル：還元およびアルキル化に続いて、SP4プロトコルを実施し、80μLのLC/MSグレードアセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させる。混合物を遠心分離して上清を分離し、ペレットをエタノールで3回洗浄して完全な精製を行う。
• 消化：精製されたペレットを、凍結乾燥粉末トリプシン（粉末シーケンシンググレード修飾トリプシン）に25 mM炭酸水素アンモニウム20μLを添加して調製したストックトリプシンで再懸濁し、37℃で一晩インキュベートする。

- 刺激なし全唾液（uWMS）サンプルは唾液分泌速度を測定するために使用されます。 唾液分泌速度（mL/分）は次のように計算されます：

唾液分泌速度（mL/分）=（唾液入りチューブの重量 - 空のチューブの重量）÷ 採取時間（分）。

• 唾液pH測定には、非刺激全唾液（uWMS）サンプルを使用します。
• 唾液採取後、単一電極デジタルpH計（ルートロン電子企業株式会社、モデルPH-208、台湾）を用いて唾液pHを測定します。

• 唾液の微生物組成は、DNA抽出と16S rRNAシーケンシングにより特徴付けられ、PMPR後の口腔マイクロバイオームの変化を観察します。-
• 目的：PMPR後の口腔マイクロバイオームの変化を特徴付けること。
• 方法・技術：DNA抽出；16S rRNAシーケンシング。
• 細菌ゲノムDNAは、標準的な方法または市販キットを用いてWMSおよびAEPサンプルから抽出されます。 抽出されたDNAは、16S rRNA遺伝子断片（500-1,500 bp）のPCR増幅の鋳型として使用されます。 - 調製された唾液およびペリクルサンプルは、テンプル大学（米国）の口腔マイクロバイオーム研究ラボに送られ、材料移転契約（MTA）の下でDNA抽出と16S rRNAシーケンシングが行われます。 - 微生物DNAは、Qiagen QIAampまたはVazyme VAMNEキットを用いて1-3 mLのサンプルから抽出されます。 DNA定量は蛍光測定法（Qubit）で行われ、純度は吸光度で評価されます。 3つの滅菌水ブランクが対照として含まれます。

- タンパク質プロファイルはAEPで評価されます。 目的は、歯面保護的対病原性タンパク質変化を理解することです。 ペリクルはフィルターストリップを使用して収集され、タンパク質溶出と分析が行われます。

評価されるパラメーター：構造的および機能的タンパク質変異（例：アルブミン、シスタチン、ムチン、PRP）。 - 目的：主要な構造タンパク質変化を研究期間全体で検出し比較すること。 - 方法／技術：SDS-PAGEおよびウェスタンブロット。 SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、分子量5〜250 kDaのタンパク質を分離するために一般的に使用される不連続電気泳動法です。 SDSは界面活性剤として作用し、タンパク質の自然電荷をマスクしてほぼ同一の電荷質量比を与えます。 一定の電場下では、タンパク質はその質量によって決定される速度で陽極に向かって移動し、正確なサイズベースの分離が可能になります。ウェスタンブロットは、特定のタンパク質を検出および定量するために使用される分子技術です。

• 目的: 口腔内細菌叢の硝酸塩還元能を評価する。
• 一酸化窒素経路における細菌の役割を評価する。
• 方法: 硝酸塩洗口; インキュベーション; 遠心分離; 亜硝酸塩定量。

WMSサンプルにおける硝酸塩還元活性を評価するために、1011 mgの硝酸カリウムを1 Lの超純水に溶解してストック溶液を調製する。 10 mLのアリコートを15 mLファルコンチューブに分注し、使用まで-20°Cで保存する。

• 手順として、1つのアリコートを解凍し、洗口液として使用する。 参加者はタイマーで計測しながら10 mLの溶液で5分間口をすすぐ。 吐き出された洗口液を50 mLファルコンチューブに回収し、マイクロ遠心チューブに移す。
• サンプルを10,000 rpmで10分間遠心分離する。 上清を回収し、新しいチューブに移し、亜硝酸塩濃度の後日分析のために-20°Cで保存する。

• 上腕動脈FMDは、前腕カフの膨張によって誘発される5分間の虚血刺激後の内皮機能を評価するために使用されます。測定は、カフを肘頭突起の遠位に配置した状態で、右腕を仰臥位で行います。
• 12MHzのリニアアレイ超音波プローブを使用して上腕動脈を撮像し、同時にBモード画像とドップラー血流速度トレースを記録します。深度、焦点、ゲイン設定は一貫して維持され、再現性のためにトランスデューサーの位置が記録されます。
• 60秒のベースライン後、カフを220 mmHgで5分間膨張させます。超音波記録は、膨張中および減圧後3分間継続して行われます。すべてのスキャンは、各参加者に対して同じ研究者によって実施されます。
• 上腕動脈の直径、血流、およびせん断速度は、研究者のバイアスを最小限に抑えるために、自動エッジ検出およびウォールトラッキングソフトウェアを使用して分析されます。

• イオントフォレーシスは、低強度の電流を用いた経皮薬物送達により、微小血管内皮機能を評価するために使用されます。 参加者は、前腕掌側にアセチルコリン（ACh, 1%）およびニトロプルシドナトリウム（SNP, 0.01%）を投与される前に、23℃に保たれた室内で30分間順応します。
• 皮膚は注射用水で清拭され、陽極と陰極として2つのアクリル製リングが配置され、イオントフォレーシスコントローラーに接続されます。 各チャンバーには0.5 mLの薬液が充填されます。 刺激プロトコルは、25 μAでの4回のパルスに続き、50、100、150、200 μAでの単一パルスを含み、各パルスは20秒間持続し、120秒間隔で実施されます。
• 皮膚血流は、パーフュージョンモニターに接続されたレーザードップラープローブを用いて測定され、PowerLabおよびLabChartソフトウェアによりデータが記録されます。 皮膚血管コンダクタンス（CVC）は、皮膚フラックス／平均動脈圧（MAP）として算出されます。

• 心拍出量（CO）は、胸部電極配置を伴うPhysio Flow PF-05 Lab1デバイスを用いて非侵襲的に測定されます。胸骨柄と下胸部に配置された2つの電極は心拍数のためのEKGを監視し、首の付け根と剣状突起に配置された4つの電極はインピーダンス信号を測定します。
• 信号品質を最適化するため、皮膚は剃毛と清拭によって準備されます。ペースメーカーを装着している参加者については、首の電極はデバイスの反対側に配置されます。キャリブレーションは、同時血圧測定と共に30回の心拍にわたる安定した信号を取得することによって行われます。
• システムは心拍数、一回拍出量、CO、およびその他の血行動態パラメータを提供し、データは分析のためにレビューされ保存されます。

• オゾンベースのケミルミネッセンス（生化学的試験）を用いて、唾液サンプル中の一酸化窒素（NO）代謝物、主に亜硝酸塩（NO₂⁻）を測定します。 この方法では、NOがオゾンと反応して励起状態の二酸化窒素を生成し、ケミルミネッセント信号として検出されます。
• 唾液サンプル中の亜硝酸塩濃度は、Sievers一酸化窒素分析装置（Sievers NOA 280i）を使用して分析されます。

• 生化学的検査であるオゾン化学発光法を用いて、唾液試料中の硝酸塩（NO₃⁻）などの一酸化窒素（NO）代謝物を測定します。 この方法では、NOがオゾンと反応して励起状態の二酸化窒素を生成し、化学発光シグナルとして検出されます。
• 唾液試料の硝酸塩濃度は、Sievers一酸化窒素分析装置（Sievers NOA 280i）を使用して分析します。

• 安静な部屋で30分間着席安静後、自動血圧計を用いて上腕動脈の血圧を測定します。 各測定間に1分間の休息を挟み、連続5回の測定を行います。
• 収縮期血圧（SBP）、拡張期血圧（DBP）、平均血圧（MAP）の平均値を含む、3回の測定値の平均を記録します。

• 酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）Duosetキットを使用して、IL-6、IL-10、TNFαを含む血液バイオマーカーを定量し、全身性炎症と歯周病および血管機能との関連を評価します。 キットはサンドイッチELISA法を採用しており、キャプチャー抗体がマイクロプレートに予めコーティングされ、その後サンプルを添加します。
• この方法により、参加者の血液サンプルからサイトカインと急性期タンパク質を正確に測定できます。 高い特異性と感度により、炎症促進性（IL-6、TNFα）と抗炎症性（IL-10）マーカーの両方を検出可能です。 結果は、PMPR治療前後の炎症反応とその調節に関する知見を提供します。

歯周ポケットプロービング時の出血（BoP）に対する歯周病的プラーク機械的除去（PMPR）と0.2％CHX洗口液の併用療法の有効性を評価・判定するために

• BoPは、各歯の6部位で記録され、0（最小）＝出血なし、1（最大）＝プロービング時の出血として記録されます。
• スコアは、参加者ごとの出血部位の割合（最小から最大の範囲0〜100％）として表されます。
• スコアが低いほど歯周病の転帰が良好であり、減少はPMPR±CHX洗口液後の改善を反映します。
• このアウトカムは、歯周病患者におけるPMPR補助療法としてのCHX洗口液の短期臨床的有効性を評価します。

歯周ポケット深さ（PPD）に対する歯周機械的プラーク除去（PMPR）と0.2％CHX洗口液の併用療法の有効性を評価・測定するため

• PPDは各歯の6部位でミリメートル単位で測定され、以下のように分類されます：0（最小）= ≤3 mm、1 = 4-5 mm、2（最大）= ≥6 mm。 スコアが低いほど、歯周治療の結果が良好であることを示します。 - 有効性は、PPDの平均変化（mm）およびポケット閉鎖の割合（ベースライン時PPDが≥4 mmの部位が追跡調査時までに≤3 mmに減少したと定義）として評価されます。
• この結果は、歯周疾患を有する個人におけるPMPRに付加的なCHX洗口液の短期的臨床的有効性を評価します。

歯周組織の機械的プラーク除去（PMPR）と0.2％CHX洗口液の併用が臨床的付着レベル（CAL）に及ぼす有効性を評価・検討するために

• 臨床的付着レベル（CAL）は、プロービングポケットデプスと歯肉退縮の測定値を組み合わせて算出されます。
• CALは、各歯の6箇所でミリメートル単位で測定され、以下のように分類されます：0（最小）= 0-2 mm、1 = 3-4 mm、2（最大）= 5 mm以上。
• その後、2つの群（PMPR + CHX対PMPR + プラセボ）間でCALの平均変化（mm）を比較します。
• スコアが低いほど歯周治療の結果が良好であることを示し、減少はPMPR ± CHX洗口液使用後の付着獲得を反映します。
• この指標は、歯周疾患を有する個人において、PMPRに付随するCHX洗口液の短期的な臨床的有効性を評価するために使用されます。

歯周病用機械的プラーク除去（PMPR）と0.2% CHXマウスウォッシュの併用がプラーク指数（PI）に及ぼす有効性を評価・検討することを目的とする。

• Turesky修正スコアリング基準を用いて、歯（第三大臼歯を除く）の頬側および舌側表面のPIを記録するために、0,1,2,3,4,5のスコアが使用される。
• スコアリングシステム：
• 0（最小）= プラークなし；1 = 歯頸縁に斑点状；2 = 薄い帯状（≤1 mm）；3 = 帯状（>1 mm）で表面の＜1/3を覆う；4 = プラークが表面の≥1/3〜＜2/3を覆う；5（最大）= プラークが表面の≥2/3を覆う。
• すべての表面のスコアを平均化し、最小から最大までの平均PIスコア（範囲0-5）を得る。
• スコアが低いほど口腔衛生状態が良好であり、減少はPMPR ± CHXマウスウォッシュ後の改善を示す。
• この指数は、歯周病患者において、PMPRに補助的に使用されるCHXマウスウォッシュの短期的臨床的有効性を評価するために使用される。

歯周病機械的プラーク除去（PMPR）と0.2% CHX洗口液の併用がLöe & Silness歯肉指数（GI）に及ぼす有効性を評価・測定する。

• GIは各歯の4部位（近心、遠心、頬側、舌側）で評価され、（最小0から最大3の）スコアが付けられる：0＝正常、1＝軽度炎症、2＝中等度炎症、3＝重度炎症。 全ての部位のスコアを平均し、平均GIスコア（範囲0-3）を算出する。 低いスコアはより良好な歯肉健康状態を示し；スコアの低下はPMPR ± 0.2% CHX洗口液後の改善を反映する。
• 歯肉炎重症度分類：
• 軽度歯肉炎：0.1-1.0； 中等度歯肉炎：1.1-2.0； 重度歯肉炎：2.1-3.0
• この指数は、歯周病患者において、PMPRに付加的に使用されるCHX洗口液のGIに対する短期的臨床的有効性を評価するために用いられる。