PMPR y Clorhexidina en la Enfermedad Periodontal y la Función Vascular (CHX-PMPR-PERIV)

Brazo 2 - Los participantes en este brazo recibirán PMPR con raspadores ultrasónicos en la línea de base (Visita 1) como parte de la atención rutinaria. En la Visita 2 (Día 1), los participantes serán aleatorizados para recibir un enjuague bucal placebo, idéntico en sabor, color y apariencia al enjuague bucal de clorhexidina.

- Este comparador placebo permitirá evaluar el efecto de la clorhexidina frente a ningún tratamiento antibacteriano activo, manteniendo a participantes e investigadores cegados. Los participantes seguirán el mismo régimen (enjuague de 10 ml, 1 minuto, dos veces al día durante 14 días), con recolección de muestras de saliva, AEP, sangre y mediciones de función vascular en la línea de base, Día 1, Día 14 y Día 90.

• Brazo 1
• Los participantes en este brazo recibirán PMPR con raspadores ultrasónicos en la línea de base (Visita 1), como parte de su atención estándar. En la Visita 2 (Día 1), se aleatorizarán para recibir enjuague bucal de clorhexidina al 0.2% (10 ml, 1 min, dos veces al día durante 14 días), con recolección de saliva, Película Adquirida del Esmalte (PAE), muestra de sangre y mediciones de la función vascular realizadas en la línea de base (Día 0), Día 1, Día 14 y Día 90.

• Enjuague bucal con clorhexidina

Propósito: Identificar proteínas inflamatorias y protectoras, monitorear cambios post-PMPR en la saliva.

• Método (Protocolo del Imperial College, Londres):
• Reducción y Alquilación: Una alícuota de 10 μL de saliva se descongelará y mezclará con 7 μL de tampón de bicarbonato de amonio en hielo. Para la reducción y alquilación, se añadirán 5 μL de TCEP y CAA cada uno, manteniendo un pH de 7-8 para asegurar la modificación adecuada de los enlaces disulfuro y los residuos de cisteína.
• Protocolo SP4: Tras la reducción y alquilación, se implementará el protocolo SP4 añadiendo 80 μL de acetonitrilo de grado LC/MS para precipitar las proteínas; la mezcla se centrifugará para separar el sobrenadante, y el pellet se lavará tres veces con etanol para una purificación exhaustiva.
• Digestión: El pellet purificado se resuspenderá entonces en tripsina stock añadiendo 20 μL de bicarbonato de amonio 25 mM a tripsina en polvo liofilizada (tripsina modificada de grado secuenciación en polvo) e incubará durante la noche a 37°C, e incubará durante la noche.

- Se utilizará una muestra de saliva total no estimulada (uWMS) para medir el flujo salival. El flujo salival (mL/min) se calcula como:

Flujo salival (mL/min) = (Peso del tubo con saliva - Peso del tubo vacío) ÷ Tiempo de recolección (min).

• Se utilizará una muestra de saliva total no estimulada (uWMS) para medir el pH salival.
• Tras la recolección de saliva, el pH salival se medirá utilizando un medidor de pH digital de electrodo único (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Modelo PH-208, Taiwán).

• La composición microbiana de la saliva se caracterizará mediante extracción de ADN y secuenciación del ARNr 16S para observar los cambios en el microbioma oral tras PMPR.
• Propósito: Caracterizar los cambios en el microbioma oral después de PMPR.
• Método/técnicas: Extracción de ADN; secuenciación del ARNr 16S.
• El ADN genómico bacteriano se extraerá de muestras de WMS y AEP utilizando métodos estándar o kits comerciales. El ADN extraído servirá como plantilla para la amplificación por PCR de fragmentos del gen ARNr 16S (500-1.500 pb). - Las muestras de saliva y película preparadas se enviarán al Laboratorio de Investigación del Microbioma Oral de la Universidad de Temple (EE. UU.) para extracción de ADN y secuenciación del ARNr 16S, con un Acuerdo de Transferencia de Material (MTA) vigente. - El ADN microbiano se extraerá de 1-3 mL de muestras utilizando kits Qiagen QIAamp o Vazyme VAMNE. La cuantificación de ADN se realizará mediante métodos fluorométricos (Qubit), y la pureza se evaluará por absorbancia. Se incluirán tres blancos de agua estéril como controles.

- El perfil proteico se evaluará en AEP. El propósito es comprender los cambios proteicos protectores versus patógenos en la superficie del diente. La película se recogerá utilizando tiras de filtro; elución y análisis de proteínas.

Parámetros evaluados: Variaciones estructurales y funcionales de proteínas (como albúmina, cistatinas, mucinas, PRPs). - Propósito: Detectar y comparar cambios clave en proteínas estructurales a lo largo de los puntos temporales del estudio. - Métodos/técnicas: SDS-PAGE e inmunotransferencia (Western blot). La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) es un método de electroforesis discontinua comúnmente utilizado para separar proteínas con pesos moleculares entre 5 y 250 kDa. El SDS actúa como un tensioactivo, enmascarando las cargas naturales de las proteínas y dándoles relaciones carga-masa casi idénticas. Bajo un campo eléctrico constante, las proteínas migran hacia el ánodo a velocidades determinadas por su masa, permitiendo una separación precisa basada en el tamaño. La inmunotransferencia (Western blot) es una técnica molecular utilizada para detectar y cuantificar proteínas específicas.

• Propósito: Evaluar la capacidad de reducción de nitratos de la microbiota oral.
• Evaluar el papel bacteriano en las vías del óxido nítrico.
• Método: Enjuague con nitrato; incubación; centrifugación; cuantificación de nitrito.

Para evaluar la actividad de reducción de nitratos en muestras de saliva total, se preparará una solución madre disolviendo 1011 mg de nitrato de potasio en 1 L de agua ultrapura. Se almacenarán alícuotas de 10 mL en tubos Falcon de 15 mL a -20°C hasta su uso.

• Para el procedimiento, se descongelará una alícuota y se usará como solución de enjuague. Los participantes enjuagarán su boca con 10 mL de la solución durante 5 minutos bajo supervisión cronometrada. El enjuague expectorado se recogerá en un tubo Falcon de 50 mL y se transferirá a tubos de microcentrífuga.
• Las muestras se centrifugarán a 10.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se recogerá, se transferirá a un tubo nuevo y se almacenará a -20°C para el análisis posterior de la concentración de nitrito.

• La FMD de la arteria braquial se utilizará para evaluar la función endotelial tras un estímulo isquémico de 5 minutos inducido por la inflación del manguito en el antebrazo. Las mediciones se realizarán en posición supina en el brazo derecho, con el manguito colocado distal al proceso olecranon.
• Se utilizará una sonda de ultrasonido de matriz lineal de 12 MHz para obtener imágenes de la arteria braquial mientras se registran simultáneamente imágenes en modo B y trazas de velocidad sanguínea Doppler. Los ajustes de profundidad, enfoque y ganancia permanecerán constantes, y la ubicación del transductor se documentará para garantizar la reproducibilidad.
• Tras una línea de base de 60 segundos, el manguito se inflará a 220 mmHg durante 5 minutos. Las grabaciones de ultrasonido continuarán durante la inflación y durante 3 minutos después de la desinflación. Todos los escaneos serán realizados por el mismo investigador para cada participante.
• El diámetro de la arteria braquial, el flujo sanguíneo y la tasa de cizallamiento se analizarán utilizando software automatizado de detección de bordes y seguimiento de paredes para minimizar el sesgo del investigador.

• La iontoforesis se utilizará para evaluar la función endotelial microvascular mediante la administración transdérmica de fármacos con una corriente eléctrica de baja intensidad. Los participantes se aclimatarán durante 30 minutos en una habitación mantenida a 23 °C antes de recibir acetilcolina (ACh, 1%) y nitroprusiato sódico (SNP, 0,01%) en la cara volar del antebrazo.
• La piel se limpiará con agua para inyección, y se colocarán dos anillos de perspex como ánodo y cátodo, conectados al controlador de iontoforesis. Cada cámara contendrá 0,5 mL de solución de fármaco. El protocolo de estimulación incluirá cuatro pulsos a 25 μA, seguidos de pulsos únicos a 50, 100, 150 y 200 μA, cada uno con una duración de 20 segundos y intervalos de 120 segundos.
• El flujo sanguíneo cutáneo se medirá mediante sondas de Doppler láser conectadas a un monitor de perfusión, con datos registrados mediante el software PowerLab y LabChart. La conductancia vascular cutánea (CVC) se calculará como flujo cutáneo / MAP.

• El gasto cardíaco (CO) se medirá de manera no invasiva utilizando el dispositivo Physio Flow PF-05 Lab1 con colocación de electrodos torácicos. Dos electrodos colocados en el manubrio esternal y la parte inferior del tórax monitorizarán el ECG para la frecuencia cardíaca, mientras que cuatro electrodos en la base del cuello y el proceso xifoides medirán las señales de impedancia.
• La piel se preparará mediante afeitado y limpieza para optimizar la calidad de la señal. Para participantes con marcapasos, los electrodos del cuello se colocarán opuestos al dispositivo. La calibración se realizará adquiriendo señales estables durante 30 latidos cardíacos con medición simultánea de la presión arterial.
• El sistema proporcionará frecuencia cardíaca, volumen sistólico, CO y otros parámetros hemodinámicos, con datos revisados y almacenados para su análisis.

• Se utilizará la quimioluminiscencia basada en ozono, una prueba bioquímica, para medir los metabolitos del óxido nítrico (NO), principalmente nitrito (NO₂⁻), en muestras de saliva. En este método, el NO reacciona con el ozono para producir una forma excitada de dióxido de nitrógeno, que se detecta como una señal quimioluminiscente.
• Las muestras de saliva se analizarán para determinar las concentraciones de nitrito utilizando un analizador de óxido nítrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• Se utilizará la quimioluminiscencia basada en ozono, una prueba bioquímica, para medir los metabolitos del óxido nítrico (NO), como el nitrato (NO₃⁻), en muestras de saliva. En este método, el NO reacciona con el ozono para producir una forma excitada de dióxido de nitrógeno, que se detecta como una señal quimioluminiscente.
• Las muestras de saliva se analizarán para determinar las concentraciones de nitrato utilizando un analizador de óxido nítrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• La presión arterial en la arteria braquial se medirá después de 30 minutos de reposo sentado en una habitación tranquila, utilizando un esfigmomanómetro automático. Se tomarán cinco lecturas consecutivas, con un descanso de 1 minuto entre cada medición.
• Se registrará el promedio de tres lecturas, incluyendo los valores medios de PAS, PAD y PAM.

• Se utilizarán kits Duoset de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para cuantificar biomarcadores sanguíneos, incluidos IL-6, IL-10 y TNFα, y evaluar la inflamación sistémica y su asociación con la enfermedad periodontal y la función vascular. Los kits utilizan un enfoque ELISA tipo sándwich, con un anticuerpo de captura previamente recubierto en una microplaca, seguido de la aplicación de la muestra.
• Este método permite la medición precisa de citocinas y proteínas de fase aguda a partir de muestras de sangre de los participantes. La alta especificidad y sensibilidad permiten la detección tanto de marcadores proinflamatorios (IL-6, TNFα) como antiinflamatorios (IL-10). Los resultados proporcionarán información sobre la respuesta inflamatoria y su modulación antes y después del tratamiento PMPR.

Para evaluar y valorar la eficacia de la Eliminación Mecánica de Placa Periodontal (PMPR) combinada con un colutorio de CHX al 0,2% sobre el Sangrado al Sondaje (BoP)

• El BoP se registrará en seis sitios por diente como: 0 (mínimo) = sin sangrado, 1 (máximo) = sangrado al sondaje.
• Las puntuaciones se expresarán como el porcentaje de sitios con sangrado por participante, con un rango de mínimo a máximo (0-100%).
• Puntuaciones más bajas indican un mejor resultado periodontal; una reducción refleja una mejora tras el PMPR ± colutorio de CHX.
• Este resultado evaluará la eficacia clínica a corto plazo del colutorio de CHX como coadyuvante al PMPR en personas con enfermedad periodontal.

Evaluar y valorar la eficacia de la Eliminación Mecánica de Placa Periodontal (PMPR) combinada con colutorio de CHX al 0,2% sobre la Profundidad de Sondaje Periodontal (PPD)

• La PPD se medirá en milímetros en seis sitios por diente y se clasificará como: 0 (mínimo) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (máximo) = ≥6 mm. Las puntuaciones más bajas indican un mejor resultado periodontal. - La eficacia se evaluará como cambio medio en PPD (mm) y como porcentaje de cierre de bolsa, definido como sitios con PPD basal ≥4 mm que se reducen a ≤3 mm en el seguimiento.
• Este resultado evaluará la eficacia clínica a corto plazo del colutorio de CHX como coadyuvante de la PMPR en personas con enfermedad periodontal.

Para evaluar y valorar la eficacia de la eliminación mecánica de placa periodontal (PMPR) combinada con colutorio de CHX al 0,2% sobre el nivel de inserción clínica (CAL)

• El nivel de inserción clínica (CAL) se calculará combinando las mediciones de la profundidad de sondaje de la bolsa y la recesión gingival.
• El CAL se medirá en milímetros en seis sitios por diente y se clasificará como: 0 (mínimo) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (máximo) = ≥5 mm.
• Posteriormente, se comparará el cambio medio en el CAL (mm) entre los dos grupos (PMPR + CHX frente a PMPR + placebo).
• Puntuaciones más bajas indican un mejor resultado periodontal; una reducción refleja una ganancia de inserción tras el uso de PMPR ± colutorio de CHX.
• Este índice se utilizará para evaluar la eficacia clínica a corto plazo del colutorio de CHX, como coadyuvante de la PMPR, en personas con enfermedad periodontal.

Para evaluar y valorar la eficacia de la Eliminación Mecánica de Placa Periodontal (EMPP) combinada con colutorio de CHX al 0,2% en el índice de placa (IP).

• Se utilizará una puntuación de 0,1,2,3,4,5 para registrar el IP en las superficies bucales y linguales de los dientes (excepto los terceros molares) empleando los criterios de puntuación modificados de Turesky.
• Sistema de puntuación:
• 0 (mínimo)= Sin placa; 1 = motas en el margen cervical; 2 = banda fina ≤1 mm; 3 = banda >1 mm cubriendo <⅓ de la superficie; 4 = placa cubriendo ≥⅓-<⅔; 5 (máximo)= placa cubriendo ≥⅔ de la superficie.
• Las puntuaciones se promediarán en todas las superficies para obtener una puntuación media de IP desde el mínimo al máximo, con un rango de 0-5.
• Puntuaciones más bajas indican mejor higiene oral; una reducción refleja mejora tras EMPP ± colutorio de CHX.
• Este índice se utilizará para valorar la eficacia clínica a corto plazo del colutorio de CHX, como coadyuvante a la EMPP, en individuos con enfermedad periodontal.

Evaluar y valorar la eficacia de la Eliminación Mecánica de la Placa Periodontal (PMPR) combinada con colutorio de CHX al 0,2% sobre el Índice Gingival de Löe & Silness (GI).

• El GI se evaluará en cuatro sitios por diente (mesial, distal, vestibular, lingual) y se puntuará (de un mínimo de 0 a un máximo de 3) con: 0 = normal, 1 = inflamación leve, 2 = inflamación moderada, 3 = inflamación grave. Las puntuaciones se promediarán en todos los sitios para obtener una puntuación media del GI (rango 0-3). Puntuaciones más bajas indican mejor salud gingival; una reducción refleja mejora tras PMPR ± colutorio de CHX al 0,2%.
• Clasificación de la gravedad de la gingivitis:
• Gingivitis leve: 0,1-1,0; Gingivitis moderada: 1,1-2,0; Grave: 2,1-3,0
• Este índice se utilizará para evaluar la eficacia clínica a corto plazo del colutorio de CHX sobre el GI, como coadyuvante de la PMPR, en individuos con enfermedad periodontal.