PMPR a chlorhexidin u parodontálního onemocnění a vaskulární funkce (CHX-PMPR-PERIV)

Skupina 2 - Účastníci v této skupině obdrží profesionální mechanické odstranění plaku pomocí ultrazvukových scalerů při vstupním vyšetření (Návštěva 1) jako součást rutinní péče. Při Návštěvě 2 (Den 1) budou účastníci randomizováni k používání placebové ústní vody, která je identická v chuti, barvě a vzhledu s chlorhexidinovou ústní vodou.

- Toto placebové srovnání umožní vyhodnocení účinku chlorhexidinu versus žádné aktivní antibakteriální léčby, přičemž účastníci i výzkumníci zůstanou zaslepeni. Účastníci dodržují stejný režim (10 ml výplachu, 1 minuta, dvakrát denně po dobu 14 dnů), přičemž vzorky slin, AEP, krve a měření vaskulární funkce jsou odebírány při vstupním vyšetření, Dni 1, Dni 14 a Dni 90.

• Skupina 1
• Účastníci v této skupině podstoupí profesionální mechanické odstranění zubního plaku pomocí ultrazvukových scalerů výchozím bodě (Návštěva 1) jako součást standardní péče. Při Návštěvě 2 (Den 1) budou randomizováni k používání 0,2% chlorhexidinové ústní vody (10 ml, 1 minuta, dvakrát denně po dobu 14 dnů), přičemž odběr slin, získaného zubního pelikulu (AEP), odběr vzorků krve a měření cévní funkce budou provedeny ve výchozím bodě (Den 0), Dni 1, Dni 14 a Dni 90.

• Chlorhexidin ústní voda

Účel: Identifikovat zánětlivé a ochranné proteiny, sledovat změny po PMPR ve slinách.

• Metoda (Protokol z Imperial College, Londýn):
• Redukce a alkylace: 10 µL alikvot slin se rozmrazí a smíchá s 7 µL amonium bikarbonátového pufru na ledu. Pro redukci a alkylaci se přidá 5 µL TCEP a CAA, přičemž se udržuje pH 7-8, aby se zajistila správná modifikace disulfidových vazeb a cysteinových zbytků.
• Protokol SP4: Po redukci a alkylaci se provede protokol SP4 přidáním 80 µL acetonitrilu třídy LC/MS k vysrážení proteinů; směs se odstředí k oddělení supernatantu a pelet se třikrát promyše ethanolem pro důkladnou purifikaci.
• Digesce: Purifikovaný pelet se poté resuspenduje v zásobním trypsinu přidáním 20 µL 25 mM amonium bikarbonátu k lyofilizovanému práškovému trypsinu (práškový trypsin modifikovaný pro sekvenování) a inkubuje se přes noc při 37°C.

- Vzorek nestimulovaných slin z celé ústní dutiny (uWMS) bude použit pro měření průtoku slin. Průtok slin (mL/min) se vypočítá jako:

Průtok slin (mL/min) = (hmotnost zkumavky se slinami - hmotnost prázdné zkumavky) ÷ doba sběru (min).

• Vzorek nestimulovaných slin z celé ústní dutiny (uWMS) bude použit k měření pH slin.
• Po odběru slin bude pH slin měřeno pomocí jednoelektrodového digitálního pH metru (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Model PH-208, Tchaj-wan).

• Mikrobiální složení slin bude charakterizováno extrakcí DNA a sekvenováním 16S rRNA za účelem sledování změn v orálním mikrobiomu po PMPR.
• Účel: Charakterizovat změny v orálním mikrobiomu po PMPR.
• Metoda/techniky: Extrakce DNA; sekvenování 16S rRNA.
• Bakteriální genomická DNA bude extrahována ze vzorků WMS a AEP pomocí standardních metod nebo komerčních souprav. Extrahovaná DNA bude sloužit jako matrice pro PCR amplifikaci fragmentů genu 16S rRNA (500-1 500 bp). - Připravené vzorky slin a pelikuly budou odeslány do Laboratoře pro výzkum orálního mikrobiomu na Temple University (USA) pro extrakci DNA a sekvenování 16S rRNA, s platnou smlouvou o převodu materiálu (MTA). - Mikrobiální DNA bude extrahována z 1-3 ml vzorků pomocí souprav Qiagen QIAamp nebo Vazyme VAMNE. Kvantifikace DNA bude provedena fluorometrickými metodami (Qubit) a čistota bude hodnocena měřením absorbance. Jako kontroly budou zahrnuty tři sterilní vodní blanky.

- Proteinový profil bude vyhodnocen v AEP. Účelem je pochopit ochranné vs. patogenní změny proteinů na povrchu zubu. Pelička bude odebrána pomocí filtračních proužků; proteinová eluce a analýza.

Hodnocené parametry: Strukturální a funkční variace proteinů (jako albumin, cystatiny, muciny, PRPs). - Účel: Detekovat a porovnat klíčové strukturální změny proteinů v průběhu časových bodů studie. - Metody/techniky: SDS-PAGE a Western blot. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) je diskontinuální elektroforetická metoda běžně používaná k separaci proteinů s molekulovou hmotností mezi 5 a 250 kDa. SDS působí jako povrchově aktivní látka, maskující přirozené náboje proteinů a poskytující jim téměř identické poměry náboje k hmotnosti. Pod konstantním elektrickým polem migrují proteiny směrem k anodě rychlostmi určenými jejich hmotností, což umožňuje přesnou separaci na základě velikosti. Western blot je molekulární technika používaná k detekci a kvantifikaci specifických proteinů

• Účel: Vyhodnotit kapacitu ústní mikrobioty k redukci dusičnanů.
• Vyhodnotit roli bakterií v dráhách oxidu dusnatého.
• Metoda: Výplach dusičnanem; inkubace; centrifugace; kvantifikace dusitanů.

Pro posouzení aktivity redukce dusičnanů ve vzorcích WMS bude připraven zásobní roztok rozpuštěním 1011 mg dusičnanu draselného v 1 L ultračisté vody. Alikvoty po 10 mL budou skladovány ve zkumavkách Falcon o objemu 15 mL při -20 °C do použití.

• Pro postup bude jedna alikvota rozmražena a použita jako výplachový roztok. Účastníci si pod časovaným dohledem vypláchnou ústa 10 mL roztoku po dobu 5 minut. Vyplivnutý výplach bude shromážděn ve zkumavce Falcon o objemu 50 mL a přenesen do mikrozkumavek.
• Vzorky budou centrifugovány při 10 000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant bude odebrán, přenesen do nové zkumavky a skladován při -20 °C pro pozdější analýzu koncentrace dusitanů.

• K hodnocení endotelové funkce po 5minutovém ischemickém podnětu vyvolaném nafouknutím manžety na předloktí bude použita FMD brachiální tepny. Měření bude provedeno v poloze na zádech na pravé paži, s manžetou umístěnou distálně od olekranonálního výběžku.
• K zobrazení brachiální tepny bude použit lineární ultrazvukový sonda 12 MHz, přičemž budou současně zaznamenávány B-režimové snímky a Dopplerovy křivky rychlosti průtoku krve. Nastavení hloubky, zaostření a zesílení zůstanou konzistentní a poloha sondy bude zdokumentována pro reprodukovatelnost.
• Po 60sekundové výchozí fázi bude manžeta nafouknuta na 220 mmHg po dobu 5 minut. Ultrazvukový záznam bude pokračovat během nafukování a po dobu 3 minut po vyfouknutí. Všechna vyšetření u každého účastníka provede stejný výzkumník.
• Průměr brachiální tepny, průtok krve a smykové napětí budou analyzovány pomocí automatického softwaru pro detekci okrajů a sledování stěny, aby se minimalizovala zkreslení ze strany vyšetřovatele.

• Iontoforéza bude použita k posouzení funkce mikrovaskulárního endotelu prostřednictvím transdermálního podávání léčiva pomocí elektrického proudu nízké intenzity. Účastníci se aklimatizují po dobu 30 minut v místnosti udržované na teplotě 23 °C, než jim bude na předloktí aplikován acetylcholin (ACh, 1%) a nitroprussid sodný (SNP, 0,01%).
• Kůže bude vyčištěna vodou na injekci a dva plexisklové kroužky budou umístěny jako anoda a katoda, připojené k řídicí jednotce iontoforézy. Každá komůrka bude obsahovat 0,5 ml roztoku léčiva. Stimulační protokol bude zahrnovat čtyři pulzy při 25 µA, následované jednotlivými pulzy při 50, 100, 150 a 200 µA, každý trvající 20 sekund s 120sekundovými intervaly.
• Krevní průtok kůží bude měřen pomocí laserových Dopplerových sond připojených k monitoru perfuze, s daty zaznamenanými prostřednictvím softwaru PowerLab a LabChart. Kožní vaskulární vodivost (CVC) bude vypočítána jako kožní tok/MAP.

• Srdeční výdej (CO) bude měřen neinvazivně pomocí zařízení Physio Flow PF-05 Lab1 s umístěním hrudních elektrod. Dvě elektrody umístěné na sternálním manubriu a dolním hrudníku budou monitorovat EKG pro srdeční frekvenci, zatímco čtyři elektrody na bázi krku a xiphoidním výběžku budou měřit impedanční signály.
• Kůže bude připravena oholením a vyčištěním pro optimalizaci kvality signálu. U účastníků s kardiostimulátory budou krční elektrody umístěny naproti zařízení. Kalibrace bude provedena získáním stabilních signálů během 30 srdečních tepů s simultánním měřením krevního tlaku.
• Systém poskytne srdeční frekvenci, tepový objem, CO a další hemodynamické parametry, přičemž data budou revidována a uložena pro analýzu.

• K měření metabolitů oxidu dusnatého (NO), především dusitanu (NO₂⁻), ve vzorcích slin bude použita ozonová chemiluminiscence, což je biochemický test. V této metodě NO reaguje s ozonem za vzniku excitované formy oxidu dusičitého, která je detekována jako chemiluminiscenční signál.
• Vzorky slin budou analyzovány na koncentrace dusitanů pomocí analyzátoru oxidu dusnatého Sievers (Sievers NOA 280i).

• K měření metabolitů oxidu dusnatého (NO), jako je dusičnan (NO₃⁻), ve vzorcích slin bude použita chemiluminiscence na bázi ozonu, což je biochemický test. V této metodě NO reaguje s ozonem za vzniku excitované formy oxidu dusičitého, která je detekována jako chemiluminiscenční signál.
• Vzorky slin budou analyzovány na koncentrace dusičnanů pomocí analyzátoru oxidu dusnatého Sievers (Sievers NOA 280i).

• Krevní tlak v pažní tepně bude měřen po 30 minutách klidného sezení v tiché místnosti pomocí automatického tonometru. Bude provedeno pět po sobě jdoucích měření s 1minutovou přestávkou mezi jednotlivými měřeními.
• Bude zaznamenán průměr ze tří měření, včetně průměrných hodnot pro systolický krevní tlak (SBP), diastolický krevní tlak (DBP) a střední arteriální tlak (MAP).

• Sady Duoset pro enzymovou imunoanalýzu (ELISA) budou použity ke kvantifikaci krevních biomarkerů včetně IL-6, IL-10 a TNFα a k posouzení systémového zánětu a jeho souvislosti s parodontálním onemocněním a vaskulární funkcí. Sady používají sendvičovou metodu ELISA s předem nanesenou navazující protilátkou na mikrotitrační destičce, po které následuje aplikace vzorku.
• Tato metoda umožňuje přesné měření cytokinů a proteinů akutní fáze z krevních vzorků účastníků. Vysoká specifičnost a citlivost umožňují detekci jak prozánětlivých (IL-6, TNFα), tak protizánětlivých (IL-10) markerů. Výsledky poskytnou poznatky o zánětlivé odpovědi a její modulaci před a po léčbě PMPR.

Vyhodnotit a posoudit účinnost mechanického odstranění zubního plaku při parodontitidě (PMPR) v kombinaci s 0,2% ústní vodou CHX na krvácení při sondování (BoP)

• BoP bude zaznamenáno na šest místech u každého zubu jako: 0 (minimum) = žádné krvácení, 1 (maximum) = krvácení při sondování.
• Skóre bude vyjádřeno jako procento krvácejících míst na účastníka, s rozsahem od minima do maxima (0–100 %).
• Nižší skóre ukazuje na lepší parodontologický výsledek; snížení odráží zlepšení po PMPR ± ústní vodě CHX.
• Tento výsledek posoudí krátkodobou klinickou účinnost ústní vody CHX jako doplňku k PMPR u osob s parodontálním onemocněním.

Pro hodnocení a posouzení účinnosti mechanického odstraňování zubního plaku u parodontitidy (PMPR) v kombinaci s 0,2% CHX ústní vodou na hloubku parodontálních chobotů (PPD)

• PPD bude měřena v milimetrech na šesti místech u každého zubu a kategorizována jako: 0 (minimum) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (maximum) = ≥6 mm. Nižší skóre ukazuje na lepší parodontální výsledek. - Účinnost bude hodnocena jako průměrná změna PPD (mm) a jako procento uzavření chobotu, definováno jako místa s výchozí PPD ≥4 mm sníženou na ≤3 mm při následném vyšetření.
• Tento výsledek posoudí krátkodobou klinickou účinnost CHX ústní vody jako doplňku k PMPR u jedinců s parodontálním onemocněním.

Pro vyhodnocení a posouzení účinnosti mechanického odstraňování zubního plaku (PMPR) v kombinaci s 0,2% CHX ústní vodou na klinické úrovni připojení (CAL)

• Klinická úroveň připojení (CAL) bude vypočítána kombinací měření hloubky sondování kapes a měření gingivální recese.
• CAL bude měřena v milimetrech na šesti místech na zub a klasifikována jako: 0 (minimum) = 0–2 mm, 1 = 3–4 mm, 2 (maximum) = ≥5 mm.
• Průměrná změna CAL (mm) bude následně porovnána mezi dvěma skupinami (PMPR + CHX vs. PMPR + placebo).
• Nižší skóre znamená lepší parodontální výsledek; snížení odráží zisk připojení po použití PMPR ± CHX ústní vody.
• Tento index bude použit k posouzení krátkodobé klinické účinnosti CHX ústní vody jako doplňku k PMPR u jedinců s parodontálním onemocněním.

K vyhodnocení a posouzení účinnosti mechanického odstraňování zubního plaku (PMPR) v kombinaci s 0,2% ústní vodou CHX na index plaku (PI).

• K zaznamenání PI na bukálních a lingválních plochách zubů (kromě třetích stoliček) bude použito skóre 0,1,2,3,4,5 pomocí modifikovaných Tureského kritérií.
• Bodovací systém:
• 0 (minimum) = Žádný plak; 1 = drobné skvrny u cervikálního okraje; 2 = tenký pás ≤1 mm; 3 = pás >1 mm pokrývající <⅓ plochy; 4 = plak pokrývající ≥⅓-<⅔; 5 (maximum) = plak pokrývající ≥⅔ plochy.
• Skóre bude zprůměrováno na všech plochách pro získání průměrného skóre PI od minima po maximum, v rozsahu 0-5.
• Nižší skóre indikuje lepší ústní hygienu; snížení odráží zlepšení po PMPR ± ústní vodě CHX.
• Tento index bude použit k posouzení krátkodobé klinické účinnosti ústní vody CHX, jako doplňku k PMPR, u jedinců s parodontálním onemocněním.

Vyhodnotit a posoudit účinnost periodontální mechanické odstranění zubního plaku (PMPR) v kombinaci s 0,2% ústní vodou CHX na Gingivální index (GI) podle Löe & Silness.

• GI bude hodnocen na čtyřech místech na zub (mezální, distální, bukální, lingvální) a skórován (od minimálně 0 do maximálně 3) takto: 0 = normální, 1 = mírný zánět, 2 = střední zánět, 3 = těžký zánět. Skóre bude zprůměrováno napříč všemi místy pro získání průměrného skóre GI (rozsah 0-3). Nižší skóre indikuje lepší zdraví dásní; snížení odráží zlepšení po PMPR ± 0,2% ústní vodě CHX.
• Klasifikace závažnosti gingivitidy:
• Mírná gingivitida: 0,1-1,0; Střední gingivitida: 1,1-2,0; Těžká: 2,1-3,0
• Tento index bude použit k posouzení krátkodobé klinické účinnosti ústní vody CHX na GI, jako doplněk k PMPR, u jedinců s parodontálním onemocněním.