PMPR e Clorexidina sulla Malattia Parodontale e la Funzione Vascolare (CHX-PMPR-PERIV)

Braccio 2 - I partecipanti in questo braccio riceveranno PMPR con ablatori ultrasonici al basale (Visita 1) come parte della cura di routine. Alla Visita 2 (Giorno 1), i partecipanti saranno randomizzati a ricevere un collutorio placebo, identico nel gusto, colore e aspetto al collutorio a base di clorexidina.

- Questo comparatore placebo permetterà di valutare l'effetto della clorexidina rispetto a nessun trattamento antibatterico attivo, mantenendo ciechi sia i partecipanti che i ricercatori. I partecipanti seguiranno lo stesso regime (sciacquare con 10 ml, 1 minuto, due volte al giorno per 14 giorni), con raccolta di campioni di saliva, AEP, sangue e misurazioni della funzione vascolare al basale, al Giorno 1, al Giorno 14 e al Giorno 90.

• Arm 1
• I partecipanti in questo braccio riceveranno PMPR con ablatori ultrasonici al basale (Visita 1), come parte della loro cura standard. Alla Visita 2 (Giorno 1), saranno randomizzati a ricevere collutorio allo 0,2% di clorexidina (10 ml, 1 minuto, due volte al giorno per 14 giorni), con raccolta di saliva, Pellicola Acquisita dello Smalto (AEP), campioni di sangue e misurazioni della funzione vascolare effettuate al basale (Giorno 0), Giorno 1, Giorno 14 e Giorno 90.

• Collutorio alla clorexidina

Scopo: Identificare proteine infiammatorie e protettive, monitorare i cambiamenti post-PMPR nella saliva.

• Metodo (Protocollo dell'Imperial College, Londra):
• Riduzione e Alchilazione: Un'aliquota di 10 µL di saliva sarà scongelata e mescolata con 7 µL di tampone bicarbonato d'ammonio su ghiaccio. Per la riduzione e alchilazione, saranno aggiunti 5 µL ciascuno di TCEP e CAA, mantenendo un pH di 7-8 per garantire una corretta modifica dei legami disolfuro e dei residui di cisteina.
• Protocollo SP4: Dopo la riduzione e alchilazione, verrà implementato il protocollo SP4 aggiungendo 80 µL di acetonitrile di grado LC/MS per precipitare le proteine; la miscela sarà centrifugata per separare il surnatante, e il pellet sarà lavato tre volte con etanolo per una purificazione accurata.
• Digestione: Il pellet purificato sarà quindi risospeso in tripsina stock aggiungendo 20 µL di bicarbonato d'ammonio 25 mM a tripsina liofilizzata in polvere (tripsina modificata di grado sequenziamento) e incubato a 37°C durante la notte.

- Il campione di saliva non stimolata di tutta la bocca (uWMS) verrà utilizzato per misurare la velocità di flusso salivare. La velocità di flusso salivare (mL/min) è calcolata come:

Velocità di flusso salivare (mL/min) = (Peso della provetta con saliva - Peso della provetta vuota) ÷ Tempo di raccolta (min).

• Un campione di saliva non stimolata da tutta la bocca (uWMS) verrà utilizzato per misurare il pH salivare.
• Dopo la raccolta della saliva, il pH salivare verrà misurato utilizzando un pH-metro digitale a elettrodo singolo (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Modello PH-208, Taiwan).

• La composizione microbica della saliva verrà caratterizzata mediante estrazione del DNA e sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S per osservare gli spostamenti del microbioma orale dopo il PMPR.
• Scopo: Caratterizzare gli spostamenti del microbioma orale dopo il PMPR.
• Metodo/tecniche: Estrazione del DNA; sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S.
• Il DNA genomico batterico verrà estratto dai campioni WMS e AEP utilizzando metodi standard o kit commerciali. Il DNA estratto fungerà da stampo per l'amplificazione PCR di frammenti del gene dell'RNA ribosomiale 16S (500-1.500 bp). - I campioni di saliva e pellicola preparati verranno inviati al Laboratorio di Ricerca sul Microbioma Orale della Temple University (USA) per l'estrazione del DNA e il sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S, con un Accordo di Trasferimento di Materiale (MTA) in vigore. - Il DNA microbico verrà estratto da 1-3 mL di campioni utilizzando i kit Qiagen QIAamp o Vazyme VAMNE. La quantificazione del DNA verrà eseguita utilizzando metodi fluorometrici (Qubit) e la purezza verrà valutata mediante assorbanza. Tre bianchi di acqua sterile saranno inclusi come controlli.

- Il profilo proteico sarà valutato nell'AEP. Lo scopo è comprendere le variazioni proteiche protettive rispetto a quelle patogene sulla superficie del dente. La pellicola sarà raccolta utilizzando strisce filtranti; eluizione e analisi delle proteine.

Parametri Valutati: Variazioni strutturali e funzionali delle proteine (come albumina, cistatine, mucine, PRP). - Scopo: Rilevare e confrontare i cambiamenti strutturali delle proteine chiave nei diversi punti temporali dello studio. - Metodi/tecniche: SDS-PAGE e Western blot. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) è un metodo di elettroforesi discontinua comunemente utilizzato per separare proteine con pesi molecolari compresi tra 5 e 250 kDa. L'SDS agisce come un tensioattivo, mascherando le cariche naturali delle proteine e conferendo loro rapporti carica-massa quasi identici. Sotto un campo elettrico costante, le proteine migrano verso l'anodo a velocità determinate dalla loro massa, consentendo una separazione precisa basata sulla dimensione. Il Western blot è una tecnica molecolare utilizzata per rilevare e quantificare proteine specifiche

• Scopo: Valutare la capacità di riduzione del nitrato del microbiota orale.
• Valutare il ruolo batterico nelle vie di sintesi dell'ossido nitrico.
• Metodo: Risciacquo con nitrato; incubazione; centrifugazione; quantificazione del nitrito.

Per valutare l'attività di riduzione del nitrato nei campioni di saliva mista non stimolata (WMS), verrà preparata una soluzione madre sciogliendo 1011 mg di nitrato di potassio in 1 L di acqua ultrapura. Aliquote da 10 mL verranno conservate in provette Falcon da 15 mL a -20°C fino all'uso.

• Per la procedura, un'aliquota verrà scongelata e utilizzata come soluzione per il risciacquo. I partecipanti sciacqueranno la bocca con 10 mL della soluzione per 5 minuti sotto supervisione cronometrata. Il risciacquo espettorato verrà raccolto in una provetta Falcon da 50 mL e trasferito in provette per microcentrifuga.
• I campioni verranno centrifugati a 10.000 giri/min per 10 minuti. Il surnatante verrà raccolto, trasferito in una nuova provetta e conservato a -20°C per l'analisi successiva della concentrazione di nitrito.

• La FMD dell'arteria brachiale sarà utilizzata per valutare la funzione endoteliale dopo uno stimolo ischemico di 5 minuti indotto dall'inflazione del bracciale sull'avambraccio. Le misurazioni saranno eseguite in posizione supina sul braccio destro, con il bracciale posizionato distalmente rispetto al processo olecranico.
• Una sonda ecografica lineare da 12 MHz sarà utilizzata per visualizzare l'arteria brachiale registrando simultaneamente immagini in modalità B e tracce Doppler della velocità del flusso sanguigno. Le impostazioni di profondità, fuoco e guadagno rimarranno costanti, e la posizione del trasduttore sarà documentata per garantire la riproducibilità.
• Dopo un basale di 60 secondi, il bracciale sarà gonfiato a 220 mmHg per 5 minuti. Le registrazioni ecografiche continueranno durante l'inflazione e per 3 minuti dopo lo sgonfiaggio. Tutte le scansioni saranno eseguite dallo stesso ricercatore per ciascun partecipante.
• Il diametro dell'arteria brachiale, il flusso sanguigno e il rateo di shear saranno analizzati utilizzando software automatizzato di rilevamento dei bordi e tracciamento delle pareti per minimizzare il bias dell'investigatore.

• L'iontoforesi sarà utilizzata per valutare la funzione endoteliale microvascolare attraverso la somministrazione transdermica di farmaci con una corrente elettrica a bassa intensità. I partecipanti si acclimateranno per 30 minuti in una stanza mantenuta a 23°C prima di ricevere acetilcolina (ACh, 1%) e nitroprussiato di sodio (SNP, 0.01%) sull'avambraccio volare.
• La pelle sarà pulita con acqua per iniezione, e due anelli di plexiglas saranno posizionati come anodo e catodo, collegati al controller di iontoforesi. Ogni camera conterrà 0,5 mL di soluzione farmacologica. Il protocollo di stimolazione includerà quattro impulsi a 25 µA, seguiti da impulsi singoli a 50, 100, 150 e 200 µA, ciascuno della durata di 20 secondi con intervalli di 120 secondi.
• Il flusso sanguigno cutaneo sarà misurato utilizzando sonde Laser Doppler collegate a un monitor di perfusione, con i dati registrati tramite il software PowerLab e LabChart. La conduttanza vascolare cutanea (CVC) sarà calcolata come flusso cutaneo / PAM.

• La gittata cardiaca (CO) sarà misurata in modo non invasivo utilizzando il dispositivo Physio Flow PF-05 Lab1 con posizionamento di elettrodi toracici. Due elettrodi posizionati sul manubrio sternale e sul torace inferiore monitoreranno l'ECG per la frequenza cardiaca, mentre quattro elettrodi alla base del collo e al processo xifoideo misureranno i segnali di impedenza.
• La pelle sarà preparata tramite rasatura e pulizia per ottimizzare la qualità del segnale. Per i partecipanti con pacemaker, gli elettrodi del collo saranno posizionati in posizione opposta al dispositivo. La calibrazione sarà eseguita acquisendo segnali stabili su 30 battiti cardiaci con misurazione simultanea della pressione sanguigna.
• Il sistema fornirà frequenza cardiaca, volume sistolico, CO e altri parametri emodinamici, con dati revisionati e archiviati per l'analisi.

• La chemiluminescenza basata sull'ozono, un test biochimico, sarà utilizzata per misurare i metaboliti dell'ossido nitrico (NO), principalmente nitrito (NO₂⁻), nei campioni di saliva. In questo metodo, l'NO reagisce con l'ozono per produrre una forma eccitata di biossido di azoto, che viene rilevata come segnale chemiluminescente.
• I campioni di saliva saranno analizzati per le concentrazioni di nitrito utilizzando un analizzatore di ossido nitrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• La chemiluminescenza basata sull'ozono, un test biochimico, sarà utilizzata per misurare i metaboliti dell'ossido nitrico (NO), come il nitrato (NO₃⁻), nei campioni di saliva. In questo metodo, l'NO reagisce con l'ozono per produrre una forma eccitata di diossido di azoto, che viene rilevata come un segnale chemiluminescente.
• I campioni di saliva saranno analizzati per le concentrazioni di nitrato utilizzando un analizzatore di ossido nitrico Sievers (Sievers NOA 280i).

• La pressione arteriosa nell'arteria brachiale sarà misurata dopo 30 minuti di riposo in posizione seduta in una stanza silenziosa, utilizzando uno sfigmomanometro automatico. Verranno effettuate cinque letture consecutive, con un riposo di 1 minuto tra ogni misurazione.
• Verrà registrata la media di tre letture, inclusi i valori medi per SBP, DBP e MAP.

• I kit Duoset ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) saranno utilizzati per quantificare i biomarcatori ematici, tra cui IL-6, IL-10 e TNFα, e per valutare l'infiammazione sistemica e la sua associazione con la malattia parodontale e la funzione vascolare. I kit utilizzano un approccio ELISA sandwich, con un anticorpo di cattura pre-rivestito su una micropiastra, seguito dall'applicazione del campione.
• Questo metodo consente una misurazione precisa delle citochine e delle proteine della fase acuta dai campioni di sangue dei partecipanti. L'elevata specificità e sensibilità consentono il rilevamento sia di marcatori pro-infiammatori (IL-6, TNFα) che anti-infiammatori (IL-10). I risultati forniranno informazioni sulla risposta infiammatoria e sulla sua modulazione prima e dopo il trattamento PMPR.

Valutare e valutare l'efficacia della Rimozione Meccanica della Placca Parodontale (PMPR) combinata con collutorio allo 0,2% di CHX sul Sanguinamento alla Sondatura (BoP)

• Il BOP sarà registrato in sei siti per dente come: 0 (minimo) = nessun sanguinamento, 1 (massimo) = sanguinamento alla sondatura.
• I punteggi saranno espressi come percentuale di siti sanguinanti per partecipante, con un intervallo da minimo a massimo (0-100%).
• Punteggi più bassi indicano un esito parodontale migliore; una riduzione riflette un miglioramento in seguito a PMPR ± collutorio CHX.
• Questo esito valuterà l'efficacia clinica a breve termine del collutorio CHX come adiuvante alla PMPR in individui con malattia parodontale.

Per valutare e valutare l'efficacia della rimozione meccanica della placca parodontale (PMPR) combinata con collutorio allo 0,2% di CHX sulla profondità di sondaggio parodontale (PPD)

• La PPD sarà misurata in millimetri in sei siti per dente e classificata come: 0 (minimo) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (massimo)= ≥6 mm. Punteggi più bassi indicano un esito parodontale migliore. - L'efficacia sarà valutata come variazione media della PPD (mm) e come percentuale di chiusura della tasca, definita come siti con PPD basale ≥4 mm che si riducono a ≤3 mm al follow-up.
• Questo esito valuterà l'efficacia clinica a breve termine del collutorio CHX aggiuntivo alla PMPR in individui con malattia parodontale.

Valutare e accertare l'efficacia della Rimozione Meccanica della Placca Parodontale (PMPR) combinata con collutorio CHX allo 0,2% sul Livello di Attacco Clinico (CAL)

• Il Livello di Attacco Clinico (CAL) sarà calcolato combinando le misurazioni della profondità di sondaggio delle tasche e della recessione gengivale.
• Il CAL sarà misurato in millimetri in sei siti per dente e categorizzato come: 0 (minimo) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (massimo) = ≥5 mm.
• La variazione media del CAL (mm) sarà quindi confrontata tra i due gruppi (PMPR + CHX vs. PMPR + placebo).
• Punteggi più bassi indicano un risultato parodontale migliore; una riduzione riflette un guadagno di attacco in seguito all'uso di PMPR ± collutorio CHX.
• Questo indice sarà utilizzato per valutare l'efficacia clinica a breve termine del collutorio CHX, adiuvante alla PMPR, in individui con malattia parodontale.

Valutare e valutare l'efficacia della rimozione meccanica della placca parodontale (PMPR) combinata con un collutorio allo 0,2% di CHX sull'indice di placca (PI).

• Per registrare il PI sulle superfici vestibolari e linguali dei denti (tranne i terzi molari) verrà utilizzato un punteggio di 0,1,2,3,4,5 secondo i criteri di punteggio modificati di Turesky.
• Sistema di punteggio:
• 0 (minimo) = Nessuna placca; 1 = macchie al margine cervicale; 2 = banda sottile ≤1 mm; 3 = banda >1 mm che copre <⅓ della superficie; 4 = placca che copre ≥⅓-<⅔; 5 (massimo) = placca che copre ≥⅔ della superficie.
• I punteggi verranno mediati su tutte le superfici per ottenere un punteggio PI medio da minimo a massimo, con un intervallo di 0-5.
• Punteggi più bassi indicano una migliore igiene orale; una riduzione riflette un miglioramento dopo PMPR ± collutorio CHX.
• Questo indice verrà utilizzato per valutare l'efficacia clinica a breve termine del collutorio CHX, adiuvante alla PMPR, in individui con malattia parodontale.

Valutare e determinare l'efficacia della Rimozione Meccanica della Placca Parodontale (PMPR) combinata con collutorio allo 0,2% di CHX sull'Indice Gengivale di Löe & Silness (GI).

• Il GI verrà valutato in quattro siti per dente (mesiale, distale, vestibolare, linguale) e assegnato un punteggio (da un minimo di 0 a un massimo di 3) con: 0 = normale, 1 = infiammazione lieve, 2 = infiammazione moderata, 3 = infiammazione grave. I punteggi verranno mediati su tutti i siti per ottenere un punteggio GI medio (intervallo 0-3). Punteggi più bassi indicano una migliore salute gengivale; una riduzione riflette un miglioramento successivo alla PMPR ± collutorio allo 0,2% di CHX.
• Classificazione della gravità della gengivite:
• Gengivite lieve: 0,1-1,0; Gengivite moderata: 1,1-2,0; Grave: 2,1-3,0
• Questo indice verrà utilizzato per valutare l'efficacia clinica a breve termine del collutorio CHX sul GI, come adiuvante alla PMPR, in individui con malattia parodontale.