PMPR og klorheksidin på parodontal sykdom og vaskulær funksjon (CHX-PMPR-PERIV)

Arm 2 - Deltakere i denne armen vil motta PMPR med ultralydskaler ved utgangspunktet (Besøk 1) som en del av rutinemessig behandling. Ved Besøk 2 (Dag 1) vil deltakerne bli randomisert til å motta en placebo-munnskyllevæske, identisk i smak, farge og utseende med klorheksidin-munnskyllevæsken.

- Denne placebo-komparatoren vil muliggjøre vurdering av effekten av klorheksidin kontra ingen aktiv antibakteriell behandling, samtidig som deltakere og forskere forblir blindet. Deltakerne følger samme regime (10 ml skyllevæske, 1 minutt, to ganger daglig i 14 dager), med målinger av spytt, AEP, blod og vaskulær funksjon samlet inn ved utgangspunktet, Dag 1, Dag 14 og Dag 90.

• Arm 1
• Deltakere i denne armen vil motta PMPR med ultralydscaler ved baseline (Besøk 1), som en del av deres standardbehandling. Ved Besøk 2 (Dag 1), vil de bli randomisert til å motta 0,2 % klorheksidin munnskyllevann (10 ml, 1 min, to ganger daglig i 14 dager), med spyttprøver, Acquired Enamel Pellicle (AEP), blodprøveinnsamling og måling av vaskulær funksjon utført ved baseline (Dag 0), Dag 1, Dag 14 og Dag 90.

• Klorheksidin munnvann

Formål: Å identifisere inflammatoriske og beskyttende proteiner, overvåke endringer etter PMPR i spytt.

• Metode (Protokoll fra Imperial College, London):
• Reduksjon og alkylering: En 10 µL alikvot av spytt vil bli tinet og blandet med 7 µL ammoniumbikarbonatbuffer på is. For reduksjon og alkylering vil 5 µL hver av TCEP og CAA bli tilsatt, med opprettholdelse av en pH på 7–8 for å sikre riktig modifikasjon av disulfidbindinger og cysteinrester.
• SP4-protokoll: Etter reduksjon og alkylering vil SP4-protokollen implementeres ved å tilsette 80 µL LC/MS-grad acetonitril for å utfelle proteiner; blandingen vil bli sentrifugert for å skille supernatanten, og pelletet vil bli vasket tre ganger med etanol for grundig renset.
• Fordøyelse: Det rensete pelletet vil deretter bli resuspendert i lager trypsin ved å tilsette 20 µL 25 mM ammoniumbikarbonat til liofilisert pulverisert trypsin (pulverisert sekvenseringsgrad modifisert trypsin) og inkuberes over natten ved 37°C, og inkuberes over natten.

- Ustimulert helmunnspytt (uWMS) prøve vil bli brukt til å måle spytthastighet.
Spytthastighet (mL/min) beregnes som:

Spytthastighet (mL/min) = (Vekt av rør med spytt - Vekt av tomt rør) ÷ Innsamlingstid (min).

• Et ustimulert helmunnspytt (uWMS)-prøve vil bli brukt til å måle spyttets pH-verdi.
• Etter spyttinnsamling vil spyttets pH-verdi bli målt ved hjelp av en enkelt-elektrode digital pH-måler (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Model PH-208, Taiwan).

• Mikrobiell sammensetning av spyttet vil bli karakterisert ved DNA-ekstraksjon og 16S rRNA-sekvensering for å observere endringer i oral mikrobiota etter PMPR.-
• Formål: Å karakterisere endringer i oral mikrobiota etter PMPR.
• Metode/teknikker: DNA-ekstraksjon; 16S rRNA-sekvensering.
• Bakterielt genomisk DNA vil bli ekstrahert fra WMS- og AEP-prøver ved bruk av standardmetoder eller kommersielle kit. Det ekstraherte DNAet vil tjene som mal for PCR-amplifisering av 16S rRNA-genfragmenter (500-1.500 bp). - Forberedte spytt- og pelikkelprøver vil bli sendt til Oral Microbiome Research Laboratory ved Temple University (USA) for DNA-ekstraksjon og 16S rRNA-sekvensering, med en Material Transfer Agreement (MTA) på plass. - Mikrobielt DNA vil bli ekstrahert fra 1-3 mL av prøvene ved bruk av Qiagen QIAamp- eller Vazyme VAMNE-kit. DNA-kvantifisering vil bli utført ved bruk av fluorometriske metoder (Qubit), og renhet vil bli vurdert ved absorbans. Tre sterilt vann-blanker vil bli inkludert som kontroller.

- Proteinprofilen vil bli vurdert i AEP. Formålet er å forstå tannoverflatebeskyttende versus patogene proteinendringer. Pellikel vil bli samlet ved bruk av filterstrimler; proteinelusjon og analyse.

Parametere som vurderes: Strukturelle og funksjonelle proteinvariasjoner (som albumin, cystatiner, muciner, PRP-er). - Formål: Å oppdage og sammenligne nøkkelstrukturelle proteinendringer på tvers av studiens tidsmomenter. - Metoder/teknikker: SDS-PAGE og Western blot. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) er en diskontinuerlig elektroforesemetode som vanligvis brukes til å separere proteiner med molekylvekter mellom 5 og 250 kDa. SDS fungerer som et overflateaktivt stoff, maskerer proteinenes naturlige ladninger og gir dem nesten identiske ladning-til-masse-forhold. Under et konstant elektrisk felt migrerer proteiner mot anoden med hastigheter bestemt av deres masse, noe som muliggjør nøyaktig størrelsesbasert separasjon. Western blot er en molekylær teknikk som brukes til å oppdage og kvantifisere spesifikke proteiner

• Formål: Å evaluere den orale mikrobiotas nitratreduserende kapasitet.
• Å evaluere bakteriens rolle i nitrittoksidveier.
• Metode: Nitratmunnskyl; inkubasjon; sentrifugering; nitrittkvantifisering.

For å vurdere nitratreduserende aktivitet i WMS-prøver, vil en stamopløsning bli tilberedt ved å løse opp 1011 mg kaliumnitrat i 1 L ultrapur vann. Alikvoter på 10 mL vil bli oppbevart i 15 mL Falcon-rør ved -20°C til bruk.

• For prosedyren vil én alikvot bli tinet og brukt som skylleløsning. Deltakere vil skylle munnen med 10 mL av løsningen i 5 minutter under tidsbestemt tilsyn. Den ekspeterte skylleløsningen vil bli samlet i et 50 mL Falcon-rør og overført til mikrocentrifugerør.
• Prøver vil bli sentrifugert ved 10 000 rpm i 10 minutter. Overstandsvæsken vil bli samlet, overført til et nytt rør og oppbevart ved -20°C for senere analyse av nitrittkonsentrasjon.

• Brakialarterie FMD vil bli brukt for å vurdere endotelfunksjon etter en 5-minutters iskemisk stimulus induert av underarmsmansjettinflation. Målinger vil bli utført i liggende stilling på høyre arm, med mansjetten plassert distal for olekranonprosessen.
• En 12-MHz lineær ultralydprobe vil bli brukt for å avbilde brakialarterien mens B-mode-bilder og Doppler-blodhastighetsspor registreres samtidig. Dybde, fokus og forsterkningsinnstillinger vil forbli konsistente, og transducerens plassering vil bli dokumentert for reproduserbarhet.
• Etter en 60-sekunders basislinje vil mansjetten bli oppblåst til 220 mmHg i 5 minutter. Ultralydopptak vil fortsette under oppblåsning og i 3 minutter etter avblåsning. Alle skanninger vil bli utført av samme forsker for hver deltaker.
• Brakialarteriediameter, blodstrøm og skjærhastighet vil bli analysert ved hjelp av automatisk kantdeteksjon og veggsporingsprogramvare for å minimere forskerens bias.

• Iontophorese vil bli brukt til å vurdere mikrovaskulær endotelfunksjon gjennom transdermal legemiddeladministrasjon med en lavintensitets elektrisk strøm. Deltakerne vil akklimatisere seg i 30 minutter i et rom holdt på 23°C før de får acetylkolin (ACh, 1%) og natriumnitroprussid (SNP, 0,01%) på underarmen.
• Huden vil bli renset med vann til injeksjon, og to plexiglassringer vil plasseres som anode og katode, koblet til iontoforesekontrolleren. Hver kammer vil inneholde 0,5 ml legemiddelløsning. Stimuleringsprotokollen vil inkludere fire pulser på 25 μA, etterfulgt av enkeltpulser på 50, 100, 150 og 200 μA, hver med en varighet på 20 sekunder med 120-sekunders intervaller.
• Hudblodstrømmen vil bli målt ved hjelp av Laser Doppler-prober koblet til en perfusjonsmonitor, med data registrert via PowerLab og LabChart-programvare. Kutan vaskulær konduktans (CVC) vil bli beregnet som hudfluks/MAP.

• Hjerteminuttvolum (CO) vil bli målt ikke-invasivt ved bruk av Physio Flow PF-05 Lab1-enheten med thorakal elektrodeplassering. To elektroder plassert på sternum manubrium og nedre thorax vil overvåke EKG for hjertefrekvens, mens fire elektroder ved halsbasis og xiphoidprosess vil måle impedanssignaler.
• Huden vil bli forberedt ved barbering og rengjøring for å optimalisere signalkvalitet. For deltakere med pacemakere vil halselektrodene plasseres motsatt av enheten. Kalibrering vil utføres ved å oppnå stabile signaler over 30 hjertebank med samtidig blodtrykksmåling.
• Systemet vil gi hjertefrekvens, slagvolum, CO og andre hemodynamiske parametere, med data gjennomgått og lagret for analyse.

• Ozonbasert kemiluminescens, en biokjemisk test, vil bli brukt til å måle nitrittoksid (NO)-metabolitter, primært nitritt (NO₂⁻), i spyttprøver. I denne metoden reagerer NO med ozon og produserer en eksitert form av nitrogendioksid, som detekteres som et kemiluminescerende signal.
• Spyttprøver vil bli analysert for nitrittkonsentrasjoner ved hjelp av en Sievers nitrittoksidanalysator (Sievers NOA 280i).

• Ozonbasert kemiluminescens, en biokjemisk test, vil bli brukt til å måle nitrittoksid (NO)-metabolitter, som nitrat (NO₃⁻), i spyttprøver. I denne metoden reagerer NO med ozon for å produsere en eksitert form av nitrogendioksid, som detekteres som et kemiluminescerende signal.
• Spyttprøver vil bli analysert for nitratkonsentrasjoner ved hjelp av en Sievers nitrittoksidanalysator (Sievers NOA 280i).

• Blodtrykket i brachialarterien måles etter 30 minutters sittende hvile i et stille rom, ved bruk av en automatisk blodtrykksmåler. Fem påfølgende avlesninger tas, med 1 minutts hvile mellom hver måling.
• Gjennomsnittet av tre avlesninger registreres, inkludert gjennomsnittsverdiene for systolisk blodtrykk (SBP), diastolisk blodtrykk (DBP) og middelarterietrykk (MAP).

• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Duoset-kits vil bli brukt til å kvantifisere blodbiomarkører, inkludert IL-6, IL-10 og TNFα, og for å vurdere systemisk betennelse og dens sammenheng med parodontal sykdom og vaskulær funksjon. Kitene bruker en sandwich ELISA-tilnærming, med en fangeantistoff forhåndsbelegg på en mikroplate, etterfulgt av prøveapplikasjon.
• Denne metoden gir presis måling av cytokiner og akutte fase-proteiner fra deltakernes blodprøver. Høy spesifisitet og sensitivitet muliggjør deteksjon av både pro-inflammatoriske (IL-6, TNFα) og anti-inflammatoriske (IL-10) markører. Resultatene vil gi innsikt i den inflammatoriske responsen og dens modulering før og etter PMPR-behandling.

For å evaluere og vurdere effektiviteten av Periodontal Mekanisk Plakkfjerning (PMPR) kombinert med 0,2% CHX-munnskyllevann på Blødning ved sondering (BoP)

• BoP vil bli registrert ved seks steder per tann som: 0 (minimum) = ingen blødning, 1 (maksimum) = blødning ved sondering.
• Poengsummer vil uttrykkes som prosentandelen av blødningssteder per deltaker, med et minimum til maksimum område (0–100 %).
• Lavere poengsummer indikerer et bedre periodontalresultat; en reduksjon reflekterer forbedring etter PMPR ± CHX-munnskyllevann.
• Denne resultatvariabelen vil vurdere den kortsiktige kliniske effektiviteten av CHX-munnskyllevann som tilleggsbehandling til PMPR hos personer med parodontitt.

For å evaluere og vurdere effekten av Periodontal Mekanisk Plakkfjernelse (PMPR) kombinert med 0,2% CHX-munnskyllevann på sonde dybde (PPD)

• PPD vil bli målt i millimeter på seks steder per tann og kategorisert som: 0 (minimum) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (maksimum) = ≥6 mm. Lavere skår indikerer et bedre periodontalt utfall. - Effekten vil bli vurdert som gjennomsnittlig endring i PPD (mm) og som prosentvis lommelukning, definert som steder med utgangspunkt PPD ≥4 mm som reduseres til ≤3 mm ved oppfølging.
• Denne utfallsmålingen vil vurdere den kortsiktige kliniske effekten av CHX-munnskyllevann som tilskudd til PMPR hos personer med periodontal sykdom.

For å evaluere og vurdere effektiviteten av Periodontal Mekanisk Plakkfjerning (PMPR) kombinert med 0,2 % CHX-munnskyllevann på Klinisk Festenivå (CAL)

• Klinisk Festenivå (CAL) vil bli beregnet ved å kombinere målinger av sondepunktdybde og gingival recessjon.
• CAL vil bli målt i millimeter på seks steder per tann og kategorisert som: 0 (minimum) = 0–2 mm, 1 = 3–4 mm, 2 (maksimum) = ≥5 mm.
• Gjennomsnittlig endring i CAL (mm) vil deretter bli sammenlignet mellom de to gruppene (PMPR + CHX vs. PMPR + placebo).
• Lavere skårer indikerer et bedre parodontalutfall; en reduksjon reflekterer festegevinst etter bruk av PMPR ± CHX-munnskyllevann.
• Denne indeksen vil bli brukt til å vurdere den korttidige kliniske effektiviteten av CHX-munnskyllevann, som supplement til PMPR, hos personer med parodontitt.

Å evaluere og vurdere effekten av Periodontal mekanisk plakkfjerning (PMPR) kombinert med 0,2% CHX-munnskyllevann på Plakkindeksen (PI).

• En score på 0,1,2,3,4,5 vil bli brukt til å registrere PI på bukkale og linguale overflater av tennene (unntatt tredje molarer) ved bruk av Turesky-modifiserte scoringskriterier.
• Scoringssystem:
• 0 (minimum)= Ingen plakk; 1 = flekker ved cervikal margin; 2 = tynt bånd ≤1 mm; 3 = bånd >1 mm dekker <⅓ overflate; 4 = plakk dekker ≥⅓-<⅔; 5 (maksimum)= plakk dekker ≥⅔ av overflaten.
• Scorene vil bli gjennomsnittet over alle overflater for å oppnå en gjennomsnittlig PI-score fra minimum til maksimum, med et område på 0-5.
• Lavere scorer indikerer bedre munnhygiene; en reduksjon reflekterer forbedring etter PMPR ± CHX-munnskyllevann.
• Denne indeksen vil bli brukt til å vurdere den kortsiktige kliniske effekten av CHX-munnskyllevann, som supplement til PMPR, hos individer med parodontitt.

For å evaluere og vurdere effekten av Periodontal Mekanisk Plakkfjerning (PMPR) kombinert med 0,2 % CHX-munnskyllevann på Løe & Silness Gingival Index (GI).

• GI vil bli vurdert på fire steder per tann (mesial, distal, bukkal, lingval) og poengsummen (fra minimum 0 til maksimum 3) vil være: 0 = normal, 1 = mild betennelse, 2 = moderat betennelse, 3 = alvorlig betennelse. Poengsummene vil bli gjennomsnittet over alle steder for å gi en gjennomsnittlig GI-poengsum (område 0–3). Lavere poengsummer indikerer bedre gingival helse; en reduksjon reflekterer forbedring etter PMPR ± 0,2 % CHX-munnskyllevann.
• Klassifisering av gingivitt alvorlighetsgrad:
• Mild gingivitt: 0,1–1,0; Moderat gingivitt: 1,1–2,0; Alvorlig: 2,1–3,0
• Denne indeksen vil bli brukt til å vurdere den kortsiktige kliniske effekten av CHX-munnskyllevann på GI, som et supplement til PMPR, hos personer med periodontal sykdom.