PMPR 및 클로르헥시딘의 치주 질환 및 혈관 기능에 대한 영향 (CHX-PMPR-PERIV)

군 2 - 이 군의 참가자는 일상적인 치료의 일환으로 기준선(방문 1)에서 초음파 스케일러를 사용한 PMPR을 받게 됩니다. 방문 2(1일차)에서 참가자는 클로르헥시딘 구강청결제와 맛, 색상, 외관이 동일한 위약 구강청결제를 받도록 무작위 배정됩니다.

- 이 위약 대조군은 참가자와 연구자 모두에게 맹검 상태를 유지하면서 클로르헥시딘 대 활성 항균 치료 없음의 효과를 평가할 수 있도록 합니다. 참가자는 동일한 요법(10ml 양치, 1분, 14일 동안 하루 두 번)을 따르며, 타액, AEP, 혈액 및 혈관 기능 측정은 기준선, 1일차, 14일차 및 90일차에 수집됩니다.

• 군 1
• 이 군의 참가자들은 표준 치료의 일환으로 기준 시점(방문 1)에서 초음파 스케일러를 사용한 PMPR을 받게 됩니다. 방문 2(1일차)에서는 무작위 배정을 통해 0.2% 클로르헥시딘 구강 세정액(10ml, 1분간, 14일 동안 하루 두 번)을 사용하게 되며, 타액, 획득 법랑질 피막(AEP), 혈액 샘플 수집 및 혈관 기능 측정은 기준 시점(0일차), 1일차, 14일차, 90일차에 수행됩니다.

• 클로르헥시딘 구강청결제

목적: 염증성 및 보호 단백질을 확인하고, 타액에서 PMPR 후 변화를 모니터링합니다.

• 방법 (런던 임페리얼 칼리지 프로토콜):
• 환원 및 알킬화: 10μL의 타액 샘플을 해동한 후 얼음 위에서 7μL의 암모늄 중탄산염 완충액과 혼합합니다. 환원 및 알킬화를 위해 각각 5μL의 TCEP와 CAA를 첨가하며, pH 7-8을 유지하여 이황화 결합과 시스테인 잔기의 적절한 변형을 보장합니다.
• SP4 프로토콜: 환원 및 알킬화 후, SP4 프로토콜을 적용하여 80μL의 LC/MS 등급 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 혼합물을 원심분리하여 상등액을 분리한 후, 펠릿을 에탄올로 세 번 세척하여 철저히 정제합니다.
• 소화: 정제된 펠릿은 20μL의 25mM 암모늄 중탄산염을 첨가하여 동결건조된 트립신 분말(분말 형태의 시퀀싱 등급 변형 트립신)에 재현탁한 후, 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

- 자극하지 않은 전구강 타액(uWMS) 샘플을 사용하여 타액 유속을 측정합니다. 타액 유속(mL/분)은 다음과 같이 계산됩니다:

타액 유속(mL/분) = (타액이 든 튜브 무게 - 빈 튜브 무게) ÷ 수집 시간(분).

• 자극하지 않은 전구강 타액(uWMS) 샘플을 사용하여 타액 pH를 측정합니다.
• 타액 수집 후, 단일 전극 디지털 pH 미터(루트론 일렉트로닉 엔터프라이즈 주식회사, 모델 PH-208, 대만)를 사용하여 타액 pH를 측정합니다.

• 타액의 미생물 조성은 DNA 추출과 16S rRNA 시퀀싱을 통해 특성화되어 PMPR 이후 구강 미생물군 변화를 관찰할 것입니다.
• 목적: PMPR 이후 구강 미생물군 변화를 특성화합니다.
• 방법/기술: DNA 추출; 16S rRNA 시퀀싱.
• 세균 게놈 DNA는 표준 방법 또는 상용 키트를 사용하여 WMS 및 AEP 샘플에서 추출됩니다. 추출된 DNA는 16S rRNA 유전자 단편(500-1,500 bp)의 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용됩니다. - 준비된 타액과 펠리클 샘플은 DNA 추출 및 16S rRNA 시퀀싱을 위해 미국 템플 대학교 구강 미생물군 연구실로 보내지며, 재료 이전 계약(MTA)이 체결되어 있습니다. - 미생물 DNA는 Qiagen QIAamp 또는 Vazyme VAMNE 키트를 사용하여 1-3 mL 샘플에서 추출됩니다. DNA 정량화는 형광 측정법(Qubit)을 사용하여 수행되며, 순도는 흡광도를 통해 평가됩니다. 세 개의 멸균된 물 공백 시료가 대조군으로 포함됩니다.

- 단백질 프로파일은 AEP에서 평가될 것입니다. 목적은 치아 표면 보호적 대 병원성 단백질 변화를 이해하는 것입니다. 펠리클은 필터 스트립을 사용하여 수집됩니다; 단백질 용출 및 분석.

평가 매개변수: 구조적 및 기능적 단백질 변이(예: 알부민, 시스타틴, 뮤신, PRP). - 목적: 연구 시점 간 주요 구조적 단백질 변화를 감지하고 비교합니다. - 방법/기술: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯. 소듐 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)은 분자량이 5~250 kDa 사이인 단백질을 분리하는 데 일반적으로 사용되는 불연속 전기영동 방법입니다. SDS는 계면활성제로 작용하여 단백질의 자연 전하를 가리고 거의 동일한 전하 대 질량 비율을 부여합니다. 일정한 전기장 아래에서 단백질은 질량에 따라 결정된 속도로 양극을 향해 이동하여 정확한 크기 기반 분리가 가능합니다. 웨스턴 블롯은 특정 단백질을 감지하고 정량화하는 데 사용되는 분자 기술입니다.

• 목적: 구강 미생물군의 질산염 환원 능력을 평가합니다.
• 일산화질소 경로에서의 세균 역할을 평가합니다.
• 방법: 질산염 헹굼; 배양; 원심분리; 아질산염 정량.

WMS 샘플에서의 질산염 환원 활성을 평가하기 위해, 1011 mg의 질산칼륨을 1 L의 초순수에 녹여 저장 용액을 준비합니다. 10 mL의 액체를 15 mL Falcon 튜브에 분주하여 사용할 때까지 -20°C에 보관합니다.

• 절차를 위해, 한 분주액을 해동하여 헹굼 용액으로 사용합니다. 참가자는 시간을 재어 감독하에 10 mL의 용액으로 5분 동안 입을 헹굽니다. 뱉어낸 헹굼액은 50 mL Falcon 튜브에 수집되고, 마이크로원심분리 튜브로 옮겨집니다.
• 샘플은 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리됩니다. 상등액을 수집하여 새로운 튜브로 옮기고, 아질산염 농도 분석을 위해 -20°C에 보관합니다.

• 상완동맥 FMD는 팔뚝 커프 팽창에 의해 유도된 5분간의 허혈 자극 후 내피 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 측정은 오른쪽 팔에서 엎드린 자세로 수행되며, 커프는 척골 돌기 아래쪽에 배치됩니다.
• 12-MHz 선형 배열 초음파 프로브를 사용하여 상완동맥을 촬영하면서 B-모드 이미지와 도플러 혈류 속도 추적을 동시에 기록합니다. 깊이, 초점 및 이득 설정은 일관되게 유지되며, 변환기 위치는 재현성을 위해 문서화됩니다.
• 60초간의 기준 측정 후, 커프를 220 mmHg로 5분간 팽창시킵니다. 초음파 기록은 팽창 중 및 감압 후 3분 동안 계속됩니다. 모든 스캔은 각 참가자에 대해 동일한 연구원이 수행합니다.
• 상완동맥 직경, 혈류 및 전단율은 연구자 편향을 최소화하기 위해 자동화된 에지 감지 및 벽 추적 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다.

• 이온삼투법은 저강도 전류를 이용한 경피 약물 전달을 통해 미세혈관 내피 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 참가자들은 전완부에 아세틸콜린(ACh, 1%)과 나트륨 니트로프루사이드(SNP, 0.01%)를 투여받기 전에 23℃로 유지되는 방에서 30분간 적응합니다.
• 피부는 주사용 물로 청소한 후 양극과 음극으로 아크릴 링 두 개를 배치하여 이온삼투법 컨트롤러에 연결합니다. 각 챔버에는 0.5mL의 약물 용액이 포함됩니다. 자극 프로토콜은 25μA의 네 번의 펄스로 시작하여 50, 100, 150, 200μA의 단일 펄스를 순차적으로 적용하며, 각 펄스는 20초 동안 지속되고 120초 간격으로 진행됩니다.
• 피부 혈류는 레이저 도플러 프로브를 사용하여 관류 모니터에 연결하고, PowerLab 및 LabChart 소프트웨어를 통해 데이터를 기록합니다. 피부 혈관 전도도(CVC)는 피부 플럭스/평균 동맥압으로 계산됩니다.

• 심박출량(CO)은 흉부 전극 배치를 사용한 Physio Flow PF-05 Lab1 장치로 비침습적으로 측정됩니다. 흉골 갑상하부와 하부 흉부에 배치된 두 개의 전극은 심박수를 모니터링하기 위해 심전도를 기록하고, 목 기저부와 검상돌기에 배치된 네 개의 전극은 임피던스 신호를 측정합니다.
• 신호 품질을 최적화하기 위해 피부를 면도하고 청소하여 준비합니다. 페이스메이커가 있는 참가자의 경우, 목 전극은 장치 반대편에 배치됩니다. 교정은 동시 혈압 측정과 함께 30회의 안정된 심박 신호를 획득하여 수행됩니다.
• 시스템은 심박수, 박출량, 심박출량 및 기타 혈역학적 매개변수를 제공하며, 데이터는 검토 및 분석을 위해 저장됩니다.

• 오존 기반 화학발광, 생화학적 검사 방법을 사용하여 타액 샘플에서 일산화질소(NO) 대사물질, 주로 아질산염(NO₂⁻)을 측정할 것입니다. 이 방법에서는 NO가 오존과 반응하여 들뜬 상태의 이산화질소를 생성하며, 이는 화학발광 신호로 감지됩니다.
• 타액 샘플의 아질산염 농도는 Sievers 일산화질소 분석기(Sievers NOA 280i)를 사용하여 분석됩니다.

• 생화학 검사인 오존 기반 화학발광법을 사용하여 타액 샘플에서 질산염(NO₃-)과 같은 일산화질소(NO) 대사산물을 측정할 것입니다. 이 방법에서는 NO가 오존과 반응하여 들뜬 상태의 이산화질소를 생성하며, 이는 화학발광 신호로 감지됩니다.
• 타액 샘플의 질산염 농도는 Sievers 일산화질소 분석기(Sievers NOA 280i)를 사용하여 분석됩니다.

• 안정된 방에서 30분 동안 앉아서 휴식을 취한 후 자동 혈압계를 사용하여 상완동맥의 혈압을 측정합니다. 각 측정 사이에 1분간 휴식을 취하며 연속 5회 측정합니다.
• SBP, DBP 및 MAP의 평균값을 포함하여 3회 측정값의 평균을 기록합니다.

• 혈액 생체표지자, 즉 IL-6, IL-10, TNFα를 정량화하고 전신 염증과 치주 질환 및 혈관 기능의 연관성을 평가하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) Duoset 키트를 사용합니다. 이 키트는 샌드위치 ELISA 방식을 사용하며, 마이크로플레이트에 미리 코팅된 포획 항체에 샘플을 적용합니다.
• 이 방법을 통해 참가자의 혈액 샘플에서 사이토카인과 급성기 단백질을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 높은 특이성과 민감도를 통해 염증 촉진(IL-6, TNFα) 및 항염증(IL-10) 표지자를 모두 검출할 수 있습니다. 그 결과는 PMPR 치료 전후의 염증 반응과 그 조절에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.

치주 기계적 치태 제거(PMPR)와 0.2% CHX 구강청결제를 병용한 경우 탐침 시 출혈(BoP)에 대한 효과를 평가하고 측정합니다.

• BoP는 치아당 6부위에서 다음과 같이 기록됩니다: 0(최소) = 출혈 없음, 1(최대) = 탐침 시 출혈.
• 점수는 참가자당 출혈 부위의 백분율로 표시되며, 최소에서 최대 범위(0-100%)를 가집니다.
• 점수가 낮을수록 치주 건강 상태가 더 좋음을 나타내며, 감소는 PMPR ± CHX 구강청결제 후 개선을 반영합니다.
• 이 결과는 치주 질환을 가진 개인에서 PMPR에 보조적으로 사용된 CHX 구강청결제의 단기 임상 효과를 평가할 것입니다.

치주 기계적 치태 제거(PMPR)와 0.2% CHX 구강세정액의 병용 요법이 치주낭 깊이(PPD)에 미치는 효과를 평가하고 평가하기 위해

• PPD는 치아당 6개 부위에서 밀리미터 단위로 측정되며 다음과 같이 분류됩니다: 0(최소) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2(최대) = ≥6 mm. 낮은 점수는 더 나은 치주 건강 결과를 나타냅니다. - 효과는 PPD의 평균 변화(mm)와 치주낭 폐쇄 비율로 평가되며, 이는 기준선 PPD ≥4 mm인 부위가 추적 관찰 시 ≤3 mm로 감소한 경우로 정의됩니다.
• 이 결과는 치주 질환을 가진 개인에서 PMPR에 보조적으로 사용된 CHX 구강세정액의 단기 임상 효능을 평가할 것입니다.

치주 기계적 플라크 제거(PMPR)와 0.2% CHX 구강세정액의 병용요법이 임상 부착 수준(CAL)에 미치는 효과를 평가하고 측정하기 위함

• 임상 부착 수준(CAL)은 치주낭 탐침 깊이와 치은 퇴축 측정값을 결합하여 계산됩니다.
• CAL은 각 치아당 6부위에서 밀리미터 단위로 측정되며 다음과 같이 분류됩니다: 0(최소) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2(최대) = ≥5 mm.
• 그런 다음 두 그룹(PMPR + CHX 대 PMPR + 위약) 간의 CAL 평균 변화(mm)를 비교합니다.
• 점수가 낮을수록 더 나은 치주 결과를 나타내며, 감소는 PMPR ± CHX 구강세정액 사용 후 부착 획득을 반영합니다.
• 이 지표는 치주 질환 환자에서 PMPR에 보조적으로 사용되는 CHX 구강세정액의 단기 임상 효능을 평가하는 데 사용됩니다.

치주 기계적 치태 제거(PMPR)와 0.2% CHX 구강 세정액의 병용이 치태 지수(PI)에 미치는 효과를 평가하고 분석하기 위함입니다.

• 치아(사랑니 제외)의 협측과 설측 표면의 PI를 기록하기 위해 Turesky 수정 점수 기준을 사용하여 0,1,2,3,4,5 점수를 사용합니다.
• 점수 체계:
• 0(최소) = 치태 없음; 1 = 경계부에 작은 얼룩; 2 = 얇은 띠 ≤1 mm; 3 = 띠 >1 mm, 표면 <⅓ 차지; 4 = 치태가 표면 ≥⅓-<⅔ 차지; 5(최대) = 치태가 표면 ≥⅔ 차지.
• 모든 표면의 점수를 평균하여 0-5 범위의 평균 PI 점수를 최소에서 최대로 산출합니다.
• 점수가 낮을수록 구강 위생 상태가 좋음을 나타내며, 점수 감소는 PMPR ± CHX 구강 세정액 후 개선을 반영합니다.
• 이 지수는 치주 질환을 가진 개인에서 PMPR에 보조적인 CHX 구강 세정액의 단기 임상 효능을 평가하는 데 사용됩니다.

0.2% CHX 구강 세정제와 결합한 치주 기계적 치태 제거(PMPR)의 Löe & Silness 잇몸 지수(GI)에 대한 효능을 평가하고 판단하기 위해.

• GI는 치아 당 4부위(근심, 원심, 협측, 설측)에서 평가되며 최소 0에서 최대 3까지 점수가 매겨집니다: 0 = 정상, 1 = 경도 염증, 2 = 중등도 염증, 3 = 중증 염증. 점수는 모든 부위에서 평균화되어 평균 GI 점수(범위 0-3)를 제공합니다. 낮은 점수는 더 나은 잇몸 건강을 나타냅니다; 감소는 PMPR ± 0.2% CHX 구강 세정제 후의 개선을 반영합니다.
• 치은염 중증도 분류:
• 경도 치은염: 0.1-1.0; 중등도 치은염: 1.1-2.0; 중증: 2.1-3.0
• 이 지수는 치주 질환을 가진 개인에서 PMPR에 보조적으로 CHX 구강 세정제가 GI에 미치는 단기 임상 효능을 평가하는 데 사용됩니다.