PMPR och Klorhexidin vid Parodontal Sjukdom och Vaskulär Funktion (CHX-PMPR-PERIV)

Arm 2 - Deltagare i denna arm kommer att få PMPR med ultraljudsskalare vid baseline (Besök 1) som en del av rutinmässig vård. Vid Besök 2 (Dag 1) kommer deltagarna att randomiseras till att få en placebomunsköljning, identisk i smak, färg och utseende med klorhexidinmunsköljningen.

- Denna placebokomparator kommer att möjliggöra bedömning av effekten av klorhexidin jämfört med ingen aktiv antibakteriell behandling, samtidigt som deltagare och forskare hålls blindade. Deltagarna följer samma schema (10 ml sköljning, 1 minut, två gånger dagligen i 14 dagar), med saliv, AEP, blod och mätningar av vaskulär funktion som samlas in vid baseline, Dag 1, Dag 14 och Dag 90.

• Arm 1
• Deltagarna i denna arm kommer att få PMPR med ultraljudsskalare vid baslinjen (Besök 1), som en del av deras standardvård. Vid Besök 2 (Dag 1) kommer de att randomiseras till att få 0,2% klorhexidin munskölj (10 ml, 1 min, två gånger dagligen i 14 dagar), med saliv-, förvärvad emaljpellikel (AEP)-, blodprovsinsamling och mätning av vaskulär funktion vid baslinjen (Dag 0), Dag 1, Dag 14 och Dag 90.

• Klorhexidin munvatten

Syfte: Att identifiera inflammatoriska och skyddande proteiner, övervaka förändringar efter PMPR i saliv.

• Metod (Protokoll från Imperial College, London):
• Reduktion och Alkylering: En 10 µL aliquot av saliv kommer att tinas upp och blandas med 7 µL ammoniumbikarbonatbuffert på is. För reduktion och alkylering kommer 5 µL vardera av TCEP och CAA att tillsättas, med bibehållen pH på 7-8 för att säkerställa korrekt modifiering av disulfidbindningar och cysteinrester.
• SP4-protokoll: Efter reduktion och alkylering kommer SP4-protokollet att implementeras genom att tillsätta 80 µL LC/MS-grad acetonitril för att fälla ut proteiner; blandningen centrifugeras för att separera supernatantet, och pellet tvättas tre gånger med etanol för grundlig rening.
• Digestion: Det renade pelletet kommer sedan att resuspenderas i lager trypsin genom att tillsätta 20 µL 25 mM ammoniumbikarbonat till liofyliserat pulveriserat trypsin (pulveriserat sekvenseringsgrad modifierat trypsin) och inkuberas över natten vid 37°C.

- Ostimulerad helmunssaliv (uWMS) prov kommer att användas för att mäta salivflödeshastighet. Salivflödeshastighet (mL/min) beräknas som:

Salivflödeshastighet (mL/min) = (Vikt på provrör med saliv - Vikt på tomt provrör) ÷ Insamlingstid (min).

• Ett ostimulerat helmunssalivprov (uWMS) kommer att användas för att mäta salivens pH-värde.
• Efter salivinsamling kommer salivens pH-värde att mätas med en enkelt-elektrod digital pH-mätare (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Model PH-208, Taiwan).

• Mikrobiell sammansättning av saliv kommer att karakteriseras genom DNA-extraktion och 16S rRNA-sekvensering för att observera förändringar i oral mikrobiom efter PMPR.
• Syfte: Att karakterisera förändringar i oral mikrobiom efter PMPR.
• Metod/tekniker: DNA-extraktion; 16S rRNA-sekvensering.
• Bakteriellt genomiskt DNA kommer att extraheras från WMS- och AEP-prover med standardmetoder eller kommersiella kit. Det extraherade DNA:t kommer att användas som mall för PCR-amplifiering av 16S rRNA-genfragment (500-1 500 bp). - Förberedda saliv- och pellikelprover kommer att skickas till Oral Microbiome Research Laboratory vid Temple University (USA) för DNA-extraktion och 16S rRNA-sekvensering, med ett Material Transfer Agreement (MTA) på plats. - Mikrobiellt DNA kommer att extraheras från 1-3 mL prover med Qiagen QIAamp- eller Vazyme VAMNE-kit. DNA-kvantifiering kommer att utföras med fluorometriska metoder (Qubit), och renhet kommer att bedömas genom absorbans. Tre sterila vattenblanketter kommer att inkluderas som kontroller.

- Proteinprofilen kommer att bedömas i AEP. Syftet är att förstå tandyteskyddande kontra patogena proteinförändringar. Pellikeln kommer att samlas in med hjälp av filterremsor; proteinelution och analys.

Parametrar som bedöms: Strukturella och funktionella proteinvariationer (såsom albumin, cystatiner, muciner, PRP). - Syfte: Att upptäcka och jämföra nyckelstrukturella proteinförändringar över studiens tidsperioder. - Metoder/tekniker: SDS-PAGE och Western blot. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) är en diskontinuerlig elektroforesmetod som vanligtvis används för att separera proteiner med molekylvikter mellan 5 och 250 kDa. SDS fungerar som ett ytaktivt ämne, maskerar proteinernas naturliga laddningar och ger dem nästan identiska laddning-till-massaförhållanden. Under ett konstant elektriskt fält migrerar proteiner mot anoden med hastigheter bestämda av deras massa, vilket möjliggör exakt storleksbaserad separation. Western blot är en molekylär teknik som används för att upptäcka och kvantifiera specifika proteiner

• Syfte: Att utvärdera oral mikrobiotas nitratreducerande kapacitet.
• Att utvärdera bakteriers roll i kväveoxidvägar.
• Metod: Nitratmunsköljning; inkubation; centrifugering; nitritkvantifiering.

För att bedöma nitratreducerande aktivitet i WMS-prover kommer en stam­lösning att framställas genom att lösa 1011 mg kaliumnitrat i 1 L ultrapurt vatten. Alikvoter om 10 mL kommer att förvaras i 15 mL Falcon-rör vid -20°C tills användning.

• För proceduren kommer en alikvot att tinas upp och användas som sköljningslösning. Deltagare kommer att skölja munnen med 10 mL av lösningen i 5 minuter under tidsmässig övervakning. Den utspotta sköljningen kommer att samlas i ett 50 mL Falcon-rör och överföras till mikrocentrifugrör.
• Proverna kommer att centrifugeras vid 10 000 rpm i 10 minuter. Supernatanten kommer att samlas, överföras till ett nytt rör och förvaras vid -20°C för senare analys av nitritkoncentration.

• Brachialarteriens FMD kommer att användas för att bedöma endotelfunktionen efter en 5-minuters ischemisk stimulering inducerad av underarmsmanschetts inflation. Mätningarna kommer att utföras i liggande ställning på höger arm, med manschetten placerad distal om olekranonprocessen.
• En 12-MHz linjär ultraljudsprobe kommer att användas för att avbilda brachialartären samtidigt som B-mode-bilder och Dopplermätningar av blodhastighet registreras. Djup, fokus och förstärkningsinställningar kommer att hållas konsekventa, och transduktorns position kommer att dokumenteras för reproducerbarhet.
• Efter en 60-sekunders baslinje kommer manschetten att blåsas upp till 220 mmHg i 5 minuter. Ultraljudsregistreringar kommer att fortsätta under inflationen och i 3 minuter efter deflation. Alla skanningar kommer att utföras av samma forskare för varje deltagare.
• Brachialartärens diameter, blodflöde och skjuvhastighet kommer att analyseras med automatiserad kantdetektering och väggspårningsprogramvara för att minimera forskarbias.

• Jontofores kommer att användas för att bedöma mikrovaskulär endotelfunktion genom transdermal läkemedelsadministration med en lågintensiv elektrisk ström. Deltagarna kommer att acklimatisera sig i 30 minuter i ett rum som hålls vid 23°C innan de får acetylkolin (ACh, 1%) och natriumnitroprussid (SNP, 0,01%) på underarmens volarsida.
• Huden kommer att rengöras med vatten för injektion, och två plexiglasringar kommer att placeras som anod och katod, anslutna till jontoforeskontrollern. Varje kammare kommer att innehålla 0,5 ml av läkemedelslösningen. Stimuleringsprotokollet kommer att inkludera fyra pulser på 25 μA, följt av enstaka pulser på 50, 100, 150 och 200 μA, var och en varande i 20 sekunder med 120-sekunders intervall.
• Hudens blodflöde kommer att mätas med Laser Doppler-prober anslutna till en perfusionsmonitor, med data inspelade via PowerLab och LabChart-programvara. Kutan vaskulär konduktans (CVC) kommer att beräknas som hudflöde/MAP.

• Hjärtminutvolym (CO) kommer att mätas icke-invasivt med Physio Flow PF-05 Lab1-enheten med thorakal elektrodplacering. Två elektroder placerade på sternum manubrium och nedre thorax kommer att övervaka EKG för hjärtfrekvens, medan fyra elektroder vid nackbasen och xiphoidprocessen kommer att mäta impedanssignaler.
• Huden kommer att förberedas genom rakning och rengöring för att optimera signalkvaliteten. För deltagare med pacemakers kommer nackelektroderna att placeras mitt emot enheten. Kalibrering kommer att utföras genom att inhämta stabila signaler över 30 hjärtslag med samtidig blodtrycksmätning.
• Systemet kommer att tillhandahålla hjärtfrekvens, slagvolym, CO och andra hemodynamiska parametrar, med data som granskas och lagras för analys.

• Ozonbaserad kemiluminiscens, ett biokemiskt test, kommer att användas för att mäta kväveoxid (NO)-metaboliter, främst nitrit (NO₂⁻), i salivprover. I denna metod reagerar NO med ozon för att producera en exciterad form av kvävedioxid, som detekteras som en kemiluminiscerande signal.
• Salivprover kommer att analyseras för nitritkoncentrationer med hjälp av en Sievers-kväveoxidanalysator (Sievers NOA 280i).

• Ozonbaserad kemiluminiscens, ett biokemiskt test, kommer att användas för att mäta kvävemonoxid (NO)-metaboliter, såsom nitrat (NO₃⁻), i salivprover. I denna metod reagerar NO med ozon för att producera en exciterad form av kvävedioxid, som detekteras som en kemiluminiscerande signal.
• Salivprover kommer att analyseras för nitratkoncentrationer med en Sievers kvävemonoxidanalysator (Sievers NOA 280i).

• Blodtrycket i armartären kommer att mätas efter 30 minuters sittande vila i ett tyst rum med hjälp av en automatisk blodtrycksmätare. Fem på varandra följande avläsningar kommer att tas, med 1 minuts vila mellan varje mätning.
• Genomsnittet av tre avläsningar kommer att registreras, inklusive medelvärdena för systoliskt blodtryck (SBP), diastoliskt blodtryck (DBP) och medeltrycket (MAP).

• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Duoset-kit kommer att användas för att kvantifiera blodbiomarkörer, inklusive IL-6, IL-10 och TNFα, och för att bedöma systemisk inflammation och dess samband med parodontal sjukdom och vaskulär funktion. Kiten använder en sandwich-ELISA-metod, med en fångstantikropp förbehandlad på en mikroplatta, följt av provapplicering.
• Denna metod möjliggör exakt mätning av cytokiner och akutfasproteiner från deltagarnas blodprover. Hög specificitet och känslighet möjliggör detektering av både proinflammatoriska (IL-6, TNFα) och antiinflammatoriska (IL-10) markörer. Resultaten kommer att ge insikter om inflammationssvaret och dess modulering före och efter PMPR-behandling.

Att utvärdera och bedöma effekten av Periodontal Mekanisk Plackborttagning (PMPR) i kombination med 0,2 % CHX-munsköljning på Blödning vid sondering (BoP)

• BoP kommer att registreras på sex platser per tand som: 0 (minimum) = ingen blödning, 1 (maximum) = blödning vid sondering.
• Poäng kommer att uttryckas som andelen blödande platser per deltagare, med ett minsta till maximalt intervall (0-100 %).
• Lägre poäng indikerar ett bättre parodontal utfall; en minskning återspeglar förbättring efter PMPR ± CHX-munsköljning.
• Detta utfall kommer att bedöma den kortvariga kliniska effekten av CHX-munsköljning som tillägg till PMPR hos individer med parodontal sjukdom.

Att utvärdera och bedöma effekten av Periodontal mekanisk plackborttagning (PMPR) i kombination med 0,2% CHX-munsköljning på sonderingstasdjup (PPD)

• PPD kommer att mätas i millimeter på sex platser per tand och kategoriseras som: 0 (minimum) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (maximum) = ≥6 mm. Lägre poäng indikerar ett bättre parodontalresultat. - Effekten kommer att bedömas som genomsnittlig förändring i PPD (mm) och som procentandel fickstängning, definierad som platser med baseline-PPD ≥4 mm som minskar till ≤3 mm vid uppföljningen.
• Detta utfall kommer att bedöma den korttids kliniska effekten av CHX-munsköljning som tillägg till PMPR hos individer med parodontal sjukdom.

För att utvärdera och bedöma effektiviteten av Periodontal mekanisk plackborttagning (PMPR) i kombination med 0,2% CHX-munsköljning på den kliniska fästnivån (CAL)

• Klinisk fästnivå (CAL) kommer att beräknas genom att kombinera mätningar av sondpocketdjup och gingival recession.
• CAL kommer att mätas i millimeter vid sex platser per tand och kategoriseras som: 0 (minimum) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (maximum) = ≥5 mm.
• Den genomsnittliga förändringen i CAL (mm) kommer sedan att jämföras mellan de två grupperna (PMPR + CHX kontra PMPR + placebo).
• Lägre poäng indikerar ett bättre parodontal utfall; en minskning återspeglar fästvinst efter användning av PMPR ± CHX-munsköljning.
• Detta index kommer att användas för att bedöma den kortvariga kliniska effektiviteten av CHX-munsköljning, som tillägg till PMPR, hos individer med parodontalsjukdom.

För att utvärdera och bedöma effektiviteten av Periodontal mekanisk plackborttagning (PMPR) kombinerat med 0,2 % CHX-munskölj på Plackindex (PI).

• En poäng på 0,1,2,3,4,5 kommer att användas för att registrera PI på de bukkala och linguala ytorna på tänderna (förutom tredje molarer) med hjälp av Turesky-modifierade bedömningskriterier.
• Bedömningssystem:
• 0 (minimum)= Inget plack; 1 = fläckar vid cervicala kanten; 2 = tunt band ≤1 mm; 3 = band >1 mm täcker <⅓ yta; 4 = plack täcker ≥⅓-<⅔; 5 (maximum)= plack täcker ≥⅔ av ytan.
• Poängen kommer att medelvärdesberäknas över alla ytor för att få ett genomsnittligt PI-poäng från minimum till maximum, med ett intervall på 0-5.
• Lägre poäng indikerar bättre munhygien; en minskning återspeglar förbättring efter PMPR ± CHX-munskölj.
• Detta index kommer att användas för att bedöma den korttids kliniska effektiviteten av CHX-munskölj, som tillägg till PMPR, hos individer med parodontal sjukdom.

För att utvärdera och bedöma effektiviteten av mekanisk plackborttagning vid parodontit (PMPR) i kombination med 0,2% CHX-munsköljning på Löe & Silness gingivalindex (GI).

• GI kommer att bedömas på fyra platser per tand (mesial, distal, buccal, lingual) och poängsättas (från minimum 0 till maximum 3) enligt: 0 = normal, 1 = lätt inflammation, 2 = måttlig inflammation, 3 = svår inflammation. Poängen kommer att medelvärdesberäknas över alla platser för att ge ett genomsnittligt GI-poäng (intervall 0-3). Lägre poäng indikerar bättre gingivalhälsa; en minskning återspeglar förbättring efter PMPR ± 0,2% CHX-munsköljning.
• Klassificering av gingivitssvårighetsgrad:
• Lätt gingivit: 0,1-1,0; Måttlig gingivit: 1,1-2,0; Svår: 2,1-3,0
• Detta index kommer att användas för att bedöma den kortsiktiga kliniska effektiviteten av CHX-munsköljning på GI, som ett komplement till PMPR, hos individer med parodontal sjukdom.