PMPR i chlorheksydyna w chorobie przyzębia i funkcji naczyniowej (CHX-PMPR-PERIV)

Grupa 2 - Uczestnicy w tej grupie otrzymają PMPR za pomocą skalera ultradźwiękowego na początku badania (Wizyta 1) jako część rutynowej opieki. Na Wizycie 2 (Dzień 1) uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do otrzymywania placebo płynu do płukania jamy ustnej, identycznego w smaku, kolorze i wyglądzie z płynem chlorheksydynowym.

- To placebo pozwoli na ocenę efektu chlorheksydyny w porównaniu z brakiem aktywnego leczenia przeciwbakteryjnego, utrzymując zarówno uczestników, jak i badaczy w zaślepieniu. Uczestnicy stosują ten sam schemat (10 ml płukania, 1 minuta, dwa razy dziennie przez 14 dni), z pobraniem próbek śliny, AEP, krwi i pomiarami funkcji naczyniowych na początku badania, w Dniu 1, Dniu 14 i Dniu 90.

• Ramię 1
• Uczestnicy w tym ramieniu otrzymają PMPR za pomocą skalerów ultradźwiękowych w punkcie wyjściowym (Wizyta 1) jako część standardowej opieki. Na Wizycie 2 (Dzień 1) zostaną losowo przydzieleni do otrzymywania 0,2% płukanki do ust z chlorheksydyną (10 ml, 1 min, dwa razy dziennie przez 14 dni), z pobraniem śliny, nabytej błonki szkliwa (AEP), próbek krwi oraz pomiarami funkcji naczyniowych przeprowadzonymi w punkcie wyjściowym (Dzień 0), Dniu 1, Dniu 14 i Dniu 90.

• Płyn do płukania ust z chlorheksydyną

Cel: Identyfikacja białek zapalnych i ochronnych, monitorowanie zmian w ślinie po PMPR.

• Metoda (Protokół z Imperial College w Londynie):
• Redukcja i alkilacja: 10 μL próbki śliny zostanie rozmrożone i zmieszane z 7 μL buforu wodorowęglanu amonu na lodzie. Do redukcji i alkilacji dodane zostanie po 5 μL TCEP i CAA, utrzymując pH 7-8, aby zapewnić właściwą modyfikację mostków dwusiarczkowych i reszt cysteiny.
• Protokół SP4: Po redukcji i alkilacji, protokół SP4 zostanie zastosowany poprzez dodanie 80 μL acetonitrylu klasy LC/MS do wytrącenia białek; mieszaninę zostanie odwirowana w celu oddzielenia supernatant, a osad zostanie przemyty trzykrotnie etanolem w celu dokładnego oczyszczenia.
• Trawienie: Oczyszczony osad zostanie następnie zawieszony w trypsynie przez dodanie 20 μL 25 mM wodorowęglanu amonu do liofilizowanego proszku trypsyny (zmodyfikowana trypsyna do sekwencjonowania) i inkubowany przez noc w 37°C.

- Próbka niestymulowanej śliny z całej jamy ustnej (uWMS) zostanie użyta do pomiaru szybkości przepływu śliny. Szybkość przepływu śliny (ml/min) oblicza się jako:

Szybkość przepływu śliny (ml/min) = (Masa probówki ze śliną - Masa pustej probówki) ÷ Czas zbierania (min).

• Próbka niesymulowanej śliny z całej jamy ustnej (uWMS) zostanie wykorzystana do pomiaru pH śliny.
• Po pobraniu śliny pH śliny zostanie zmierzone za pomocą jednoelektrodowego cyfrowego pH-metru (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Model PH-208, Tajwan).

• Skład mikrobiologiczny śliny zostanie scharakteryzowany poprzez ekstrakcję DNA i sekwencjonowanie 16S rRNA w celu obserwacji zmian w mikrobiomie jamy ustnej po PMPR.
• Cel: Scharakteryzowanie zmian w mikrobiomie jamy ustnej po PMPR.
• Metoda/techniki: Ekstrakcja DNA; sekwencjonowanie 16S rRNA.
• Genomowe DNA bakterii zostanie wyekstrahowane z próbek WMS i AEP przy użyciu standardowych metod lub komercyjnych zestawów. Wyekstrahowane DNA posłuży jako matryca do amplifikacji PCR fragmentów genu 16S rRNA (500-1500 bp). Przygotowane próbki śliny i pelikuli zostaną przesłane do Laboratorium Badań Mikrobiomu Jamy Ustnej na Uniwersytecie Temple (USA) w celu ekstrakcji DNA i sekwencjonowania 16S rRNA, z obowiązującym Porozumieniem o Przeniesieniu Materiału (MTA). DNA mikrobiologiczne zostanie wyekstrahowane z 1-3 ml próbek przy użyciu zestawów Qiagen QIAamp lub Vazyme VAMNE. Ilościowe oznaczanie DNA zostanie przeprowadzone metodami fluorometrycznymi (Qubit), a czystość oceniona na podstawie absorbancji. Trzy sterylne próbki kontrolne z wodą będą uwzględnione jako kontrole.

- Profil białkowy będzie oceniany w AEP. Celem jest zrozumienie ochronnych vs. patogennych zmian białek na powierzchni zęba. Pellicle zostanie zebrana za pomocą pasków filtracyjnych; elucja białek i analiza.

Parametry oceniane: Strukturalne i funkcjonalne wariacje białek (takie jak albumina, cystatyny, mucyny, PRP). - Cel: Wykrycie i porównanie kluczowych zmian strukturalnych białek w różnych punktach czasowych badania. - Metody/techniki: SDS-PAGE i Western blot. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jest metodą elektroforezy nieciągłej powszechnie stosowaną do rozdzielania białek o masach cząsteczkowych między 5 a 250 kDa. SDS działa jako surfaktant, maskując naturalne ładunki białek i nadając im niemal identyczne stosunki ładunku do masy. Pod wpływem stałego pola elektrycznego białka migrują w kierunku anody z prędkościami określanymi przez ich masę, umożliwiając dokładne rozdzielenie na podstawie wielkości. Western blot to technika molekularna stosowana do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznych białek.

• Cel: Ocena zdolności redukcji azotanów przez mikrobiom jamy ustnej.
• Ocena roli bakterii w szlakach tlenku azotu.
• Metoda: Płukanie azotanem; inkubacja; wirowanie; ilościowe oznaczanie azotynów.

Aby ocenić aktywność redukcji azotanów w próbkach WMS, przygotuje się roztwór macierzysty przez rozpuszczenie 1011 mg azotanu potasu w 1 L wody ultraczystej. Alikwoty po 10 mL będą przechowywane w probówkach Falcon 15 mL w temperaturze -20°C do czasu użycia.

• Do procedury jedna alikwota zostanie rozmrożona i użyta jako roztwór do płukania. Uczestnicy będą płukać usta 10 mL roztworu przez 5 minut pod nadzorem z pomiarem czasu. Wypłukany płyn zostanie zebrany w probówce Falcon 50 mL i przeniesiony do probówek mikrowirowych.
• Próbki będą wirowane z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut. Supernatant zostanie zebrany, przeniesiony do nowej probówki i przechowywany w temperaturze -20°C do późniejszej analizy stężenia azotynów.

• FMD tętnicy ramiennej będzie stosowana do oceny funkcji śródbłonka po 5-minutowym bodźcu niedokrwiennym wywołanym przez nadmuchanie mankietu na przedramieniu. Pomiary będą wykonywane w pozycji leżącej na prawym ramieniu, z mankietem umieszczonym dystalnie do wyrostka łokciowego.
• Do obrazowania tętnicy ramiennej zostanie użyta sonda ultradźwiękowa z głowicą liniową 12 MHz, jednocześnie rejestrując obrazy w trybie B i ślady prędkości przepływu krwi w Dopplerze. Ustawienia głębokości, ostrości i wzmocnienia pozostaną niezmienne, a położenie przetwornika zostanie udokumentowane w celu odtwarzalności.
• Po 60-sekundowej linii bazowej mankiet zostanie napompowany do 220 mmHg na 5 minut. Rejestracja ultradźwiękowa będzie kontynuowana podczas napompowania i przez 3 minuty po spuszczeniu powietrza. Wszystkie skany dla każdego uczestnika będą wykonywane przez tego samego badacza.
• Średnicę tętnicy ramiennej, przepływ krwi i szybkość ścinania będzie analizowano przy użyciu automatycznego oprogramowania do wykrywania krawędzi i śledzenia ściany, aby zminimalizować stronniczość badacza.

• Jontoforeza zostanie zastosowana do oceny funkcji śródbłonka mikronaczyniowego poprzez przezskórne podanie leku przy użyciu prądu elektrycznego o niskim natężeniu. Uczestnicy będą aklimatyzować się przez 30 minut w pomieszczeniu utrzymywanym w temperaturze 23°C przed otrzymaniem acetylocholiny (ACh, 1%) i nitroprusydku sodu (SNP, 0,01%) na przedramieniu po stronie dłoniowej.
• Skóra zostanie oczyszczona wodą do wstrzykiwań, a dwa pierścienie z pleksiglasu zostaną umieszczone jako anoda i katoda, podłączone do kontrolera jontoforezy. Każda komora będzie zawierała 0,5 ml roztworu leku. Protokół stymulacji obejmie cztery impulsy o natężeniu 25 μA, a następnie pojedyncze impulsy o natężeniu 50, 100, 150 i 200 μA, każdy trwający 20 sekund z 120-sekundowymi przerwami.
• Przepływ krwi w skórze będzie mierzony za pomocą sond Laser Doppler podłączonych do monitora perfuzji, z danymi rejestrowanymi przez oprogramowanie PowerLab i LabChart. Przewodnictwo naczyniowe skóry (CVC) zostanie obliczone jako przepływ skórny/MAP.

• Pomiar rzutu serca (CO) będzie przeprowadzany nieinwazyjnie za pomocą urządzenia Physio Flow PF-05 Lab1 z umieszczeniem elektrod na klatce piersiowej. Dwie elektrody umieszczone na rękojeści mostka i dolnej części klatki piersiowej będą monitorować EKG w celu określenia częstości akcji serca, natomiast cztery elektrody u podstawy szyi i wyrostka mieczykowatego będą mierzyć sygnały impedancyjne.
• Skóra będzie przygotowana poprzez golenie i oczyszczenie w celu optymalizacji jakości sygnału. U uczestników z rozrusznikami serca elektrody szyjne będą umieszczone po przeciwnej stronie niż urządzenie. Kalibracja zostanie przeprowadzona poprzez uzyskanie stabilnych sygnałów przez 30 uderzeń serca z jednoczesnym pomiarem ciśnienia krwi.
• System dostarczy dane dotyczące częstości akcji serca, objętości wyrzutowej, rzutu serca oraz innych parametrów hemodynamicznych, a dane zostaną przejrzane i zapisane do analizy.

• Do pomiaru metabolitów tlenku azotu (NO), głównie azotynu (NO₂⁻), w próbkach śliny zastosowana zostanie chemiluminescencja oparta na ozonie, czyli test biochemiczny. W tej metodzie NO reaguje z ozonem, wytwarzając wzbudzoną formę dwutlenku azotu, która jest wykrywana jako sygnał chemiluminescencyjny.
• Próbki śliny zostaną przeanalizowane pod kątem stężenia azotynów za pomocą analizatora tlenku azotu Sievers (Sievers NOA 280i).

• Chemiluminescencja oparta na ozonie, test biochemiczny, zostanie wykorzystana do pomiaru metabolitów tlenku azotu (NO), takich jak azotan (NO₃⁻), w próbkach śliny. W tej metodzie NO reaguje z ozonem, wytwarzając wzbudzoną formę dwutlenku azotu, która jest wykrywana jako sygnał chemiluminescencyjny.
• Próbki śliny zostaną przeanalizowane pod kątem stężeń azotanów przy użyciu analizatora tlenku azotu Sievers (Sievers NOA 280i).

• Ciśnienie krwi w tętnicy ramiennej będzie mierzone po 30 minutach siedzącego odpoczynku w cichym pomieszczeniu, przy użyciu automatycznego sfigmomanometru. Pięć kolejnych odczytów zostanie wykonanych z 1-minutowymi przerwami między pomiarami.
• Zostanie zarejestrowana średnia z trzech odczytów, w tym średnie wartości SBP, DBP i MAP.

• Zestawy Duoset do testu ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) zostaną wykorzystane do ilościowego oznaczania biomarkerów krwi, w tym IL-6, IL-10 i TNFα, oraz do oceny ogólnoustrojowego stanu zapalnego i jego związku z chorobą przyzębia oraz funkcją naczyń krwionośnych. Zestawy wykorzystują metodę ELISA typu sandwich, z przeciwciałem wychwytującym wstępnie naniesionym na mikropłytkę, a następnie naniesieniem próbki.
• Ta metoda umożliwia precyzyjny pomiar cytokin i białek ostrej fazy z próbek krwi uczestników. Wysoka specyficzność i czułość pozwalają na wykrycie zarówno markerów prozapalnych (IL-6, TNFα), jak i przeciwzapalnych (IL-10). Wyniki dostarczą informacji na temat odpowiedzi zapalnej i jej modulacji przed i po leczeniu PMPR.

Ocena i analiza skuteczności mechanicznego usuwania płytki nazębnej (PMPR) w połączeniu z płukanką do ust 0,2% CHX na krwawienie przy sondowaniu (BoP)

• BOP będzie rejestrowany w sześciu miejscach na ząb jako: 0 (minimum) = brak krwawienia, 1 (maksimum) = krwawienie przy sondowaniu.
• Wyniki będą wyrażone jako odsetek krwawiących miejsc na uczestnika, w zakresie od minimum do maksimum (0-100%).
• Niższe wyniki wskazują na lepszy stan przyzębia; redukcja odzwierciedla poprawę po zastosowaniu PMPR ± płukanki CHX.
• Ten wynik oceni krótkoterminową skuteczność kliniczną płukanki CHX jako uzupełnienia PMPR u osób z chorobą przyzębia.

W celu oceny i analizy skuteczności mechanicznego usuwania płytki nazębnej (PMPR) w połączeniu z płynem do płukania jamy ustnej zawierającym 0,2% CHX na głębokość kieszonek dziąsłowych (PPD)

• PPD będzie mierzona w milimetrach w sześciu miejscach na ząb i kategoryzowana jako: 0 (minimum) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (maksimum) = ≥6 mm. Niższe wyniki wskazują na lepszy stan przyzębia. - Skuteczność będzie oceniana jako średnia zmiana PPD (mm) oraz jako odsetek zamkniętych kieszonek, zdefiniowany jako miejsca z wyjściowym PPD ≥4 mm, które zmniejszyły się do ≤3 mm w badaniu kontrolnym.
• Ten wynik oceni krótkoterminową skuteczność kliniczną płynu do płukania jamy ustnej CHX jako uzupełnienia PMPR u osób z chorobą przyzębia.

Aby ocenić i zbadać skuteczność mechanicznego usuwania płytki nazębnej w periodontologii (PMPR) w połączeniu z płukanką do ust zawierającą 0,2% CHX na poziom przyczepu klinicznego (CAL)

• Poziom przyczepu klinicznego (CAL) będzie obliczany poprzez połączenie pomiarów głębokości kieszonki dziąsłowej i recesji dziąseł.
• CAL będzie mierzony w milimetrach w sześciu miejscach na ząb i kategoryzowany jako: 0 (minimum) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (maksimum) = ≥5 mm.
• Średnia zmiana CAL (mm) będzie następnie porównywana między dwiema grupami (PMPR + CHX vs. PMPR + placebo).
• Niższe wyniki wskazują na lepszy stan periodontologiczny; redukcja odzwierciedla przyrost przyczepu po zastosowaniu PMPR ± płukanki do ust z CHX.
• Wskaźnik ten zostanie wykorzystany do oceny krótkoterminowej skuteczności klinicznej płukanki do ust z CHX, jako uzupełnienie PMPR, u osób z chorobą przyzębia.

Ocena i analiza skuteczności mechanicznego usuwania płytki nazębnej (PMPR) w połączeniu z płukaniem jamy ustnej 0,2% CHX na wskaźnik płytki nazębnej (PI).

• Do rejestrowania PI na powierzchniach policzkowych i językowych zębów (z wyłączeniem trzecich trzonowców) zostanie zastosowany wynik 0,1,2,3,4,5 przy użyciu zmodyfikowanych kryteriów oceny Turesky'ego.
• System punktacji:
• 0 (minimum) = Brak płytki; 1 = drobne skupiska przy brzegu dziąsłowym; 2 = cienki pas ≤1 mm; 3 = pas >1 mm pokrywający <⅓ powierzchni; 4 = płytka pokrywająca ≥⅓-<⅔; 5 (maksimum) = płytka pokrywająca ≥⅔ powierzchni.
• Wyniki zostaną uśrednione na wszystkich powierzchniach, aby uzyskać średni wynik PI od minimum do maksimum, w zakresie 0-5.
• Niższe wyniki wskazują na lepszą higienę jamy ustnej; redukcja odzwierciedla poprawę po PMPR ± płukaniu CHX.
• Ten wskaźnik zostanie wykorzystany do oceny krótkoterminowej skuteczności klinicznej płukania CHX, jako uzupełnienie PMPR, u osób z chorobą przyzębia.

Ocena i analiza skuteczności mechanicznego usuwania płytki nazębnej (PMPR) w połączeniu z płynem do płukania jamy ustnej zawierającym 0,2% CHX na wskaźnik dziąseł Löe & Silness (GI).

• GI będzie oceniany w czterech miejscach na ząb (przyśrodkowo, dalszo, policzkowo, językowo) i punktowany (od minimum 0 do maksimum 3) w następujący sposób: 0 = prawidłowy, 1 = łagodne zapalenie, 2 = umiarkowane zapalenie, 3 = ciężkie zapalenie. Wyniki zostaną uśrednione we wszystkich miejscach, aby uzyskać średni wynik GI (zakres 0-3). Niższe wyniki wskazują na lepszy stan dziąseł; redukcja odzwierciedla poprawę po zastosowaniu PMPR ± płynu do płukania jamy ustnej z 0,2% CHX.
• Klasyfikacja ciężkości zapalenia dziąseł:
• Łagodne zapalenie dziąseł: 0,1-1,0; Umiarkowane zapalenie dziąseł: 1,1-2,0; Ciężkie: 2,1-3,0
• Wskaźnik ten będzie używany do oceny krótkoterminowej skuteczności klinicznej płynu do płukania jamy ustnej z CHX na GI, jako uzupełnienie PMPR, u osób z chorobami przyzębia.