PMPR et chlorhexidine sur la maladie parodontale et la fonction vasculaire (CHX-PMPR-PERIV)

Bras 2 - Les participants de ce bras recevront un PMPR à l'aide de détartreurs ultrasoniques au départ (Visite 1) dans le cadre des soins de routine. À la Visite 2 (Jour 1), les participants seront randomisés pour recevoir un bain de bouche placebo, identique en goût, couleur et apparence au bain de bouche à la chlorhexidine.

- Ce comparateur placebo permettra d'évaluer l'effet de la chlorhexidine par rapport à l'absence de traitement antibactérien actif, tout en maintenant l'insu des participants et des chercheurs. Les participants suivent le même schéma (rinçage de 10 ml, 1 minute, deux fois par jour pendant 14 jours), avec des mesures de salive, AEP, sang et fonction vasculaire effectuées au départ, au Jour 1, au Jour 14 et au Jour 90.

• Bras 1
• Les participants de ce bras recevront un détartrage et un surfaçage radiculaire à l'aide de détartreurs à ultrasons au départ (Visite 1), dans le cadre de leurs soins standards. À la Visite 2 (Jour 1), ils seront randomisés pour recevoir un bain de bouche à la chlorhexidine à 0,2 % (10 ml, 1 min, deux fois par jour pendant 14 jours), avec des prélèvements de salive, de pellicule acquise de l'émail (PAE), d'échantillons sanguins, et des mesures de la fonction vasculaire effectuées au départ (Jour 0), au Jour 1, au Jour 14 et au Jour 90.

• Rince-bouche à la chlorhexidine

Objectif : Identifier les protéines inflammatoires et protectrices, surveiller les changements post-PMPR dans la salive.

• Méthode (Protocole de l'Imperial College, Londres) :
• Réduction et Alkylation : Un aliquot de 10 µL de salive sera décongelé et mélangé avec 7 µL de tampon bicarbonate d'ammonium sur glace. Pour la réduction et l'alkylation, 5 µL chacun de TCEP et de CAA seront ajoutés, en maintenant un pH de 7-8 pour assurer une modification correcte des liaisons disulfure et des résidus cystéine.
• Protocole SP4 : Suite à la réduction et à l'alkylation, le protocole SP4 sera mis en œuvre en ajoutant 80 µL d'acétonitrile de qualité LC/MS pour précipiter les protéines ; le mélange sera centrifugé pour séparer le surnageant, et le culot sera lavé trois fois avec de l'éthanol pour une purification complète.
• Digestion : Le culot purifié sera ensuite remis en suspension dans de la trypsine de stock en ajoutant 20 µL de bicarbonate d'ammonium 25 mM à de la trypsine lyophilisée en poudre (trypsine modifiée de qualité séquençage en poudre) et incubé toute la nuit à 37°C, puis incubé toute la nuit.

- L'échantillon de salive non stimulée de la bouche entière (uWMS) sera utilisé pour mesurer le débit salivaire. Le débit salivaire (mL/min) est calculé comme suit :

Débit salivaire (mL/min) = (Poids du tube avec salive - Poids du tube vide) ÷ Temps de collecte (min).

• Un échantillon de salive non stimulée de la bouche entière (uWMS) sera utilisé pour mesurer le pH salivaire.
• Après la collecte de salive, le pH salivaire sera mesuré à l'aide d'un pH-mètre numérique à électrode unique (Lutron Electronic Enterprise Co., Ltd., Modèle PH-208, Taïwan).

• La composition microbienne de la salive sera caractérisée par extraction d'ADN et séquençage de l'ARNr 16S pour observer les modifications du microbiome oral après PMPR.
• Objectif : Caractériser les modifications du microbiome oral après PMPR.
• Méthode/techniques : Extraction d'ADN ; séquençage de l'ARNr 16S.
• L'ADN génomique bactérien sera extrait des échantillons de WMS et AEP en utilisant des méthodes standard ou des kits commerciaux. L'ADN extrait servira de matrice pour l'amplification PCR des fragments du gène de l'ARNr 16S (500-1 500 pb). - Les échantillons de salive et de pellicule préparés seront envoyés au Oral Microbiome Research Laboratory de l'Université Temple (États-Unis) pour extraction d'ADN et séquençage de l'ARNr 16S, avec un accord de transfert de matériel (MTA) en place. - L'ADN microbien sera extrait de 1-3 mL d'échantillons en utilisant les kits Qiagen QIAamp ou Vazyme VAMNE. La quantification de l'ADN sera réalisée par des méthodes fluorométriques (Qubit), et la pureté sera évaluée par absorbance. Trois blancs d'eau stérile seront inclus comme témoins.

- Le profil protéique sera évalué dans l'AEP. L'objectif est de comprendre les changements protéiques protecteurs vs. pathogènes à la surface des dents. Le pellicule sera collecté à l'aide de bandes filtrantes ; élution et analyse des protéines.

Paramètres évalués : Variations structurelles et fonctionnelles des protéines (telles que l'albumine, les cystatines, les mucines, les PRP). - Objectif : Détecter et comparer les changements clés des protéines structurelles aux différents moments de l'étude. - Méthodes/techniques : SDS-PAGE et Western blot. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec du dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) est une méthode d'électrophorèse discontinue couramment utilisée pour séparer les protéines dont les poids moléculaires sont compris entre 5 et 250 kDa. Le SDS agit comme un tensioactif, masquant les charges naturelles des protéines et leur donnant des rapports charge/masse presque identiques. Sous un champ électrique constant, les protéines migrent vers l'anode à des vitesses déterminées par leur masse, permettant une séparation précise basée sur la taille. Le Western blot est une technique moléculaire utilisée pour détecter et quantifier des protéines spécifiques.

• Objectif : Évaluer la capacité de réduction des nitrates du microbiote oral.
• Évaluer le rôle des bactéries dans les voies du monoxyde d'azote.
• Méthode : Rince-bouche aux nitrates ; incubation ; centrifugation ; quantification des nitrites.

Pour évaluer l'activité de réduction des nitrates dans les échantillons de salive totale, une solution mère sera préparée en dissolvant 1011 mg de nitrate de potassium dans 1 L d'eau ultrapure. Des aliquotes de 10 mL seront stockées dans des tubes Falcon de 15 mL à -20°C jusqu'à utilisation.

• Pour la procédure, une aliquote sera décongelée et utilisée comme solution de rinçage. Les participants se rinceront la bouche avec 10 mL de la solution pendant 5 minutes sous surveillance chronométrée. Le rinçage expectoré sera collecté dans un tube Falcon de 50 mL et transféré dans des tubes microcentrifuge.
• Les échantillons seront centrifugés à 10 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant sera collecté, transféré dans un nouveau tube et stocké à -20°C pour une analyse ultérieure de la concentration en nitrites.

• La FMD de l'artère brachiale sera utilisée pour évaluer la fonction endothéliale après un stimulus ischémique de 5 minutes induit par le gonflage du brassard de l'avant-bras. Les mesures seront effectuées en position couchée sur le bras droit, avec le brassard placé distalement par rapport à l'olécrâne.
• Une sonde échographique linéaire de 12 MHz sera utilisée pour imager l'artère brachiale tout en enregistrant simultanément des images en mode B et des tracés de vélocité sanguine Doppler. Les réglages de profondeur, de focalisation et de gain resteront constants, et l'emplacement du transducteur sera documenté pour la reproductibilité.
• Après une ligne de base de 60 secondes, le brassard sera gonflé à 220 mmHg pendant 5 minutes. Les enregistrements échographiques se poursuivront pendant le gonflage et pendant 3 minutes après le dégonflage. Toutes les analyses seront effectuées par le même chercheur pour chaque participant.
• Le diamètre de l'artère brachiale, le débit sanguin et le taux de cisaillement seront analysés à l'aide d'un logiciel automatisé de détection de bord et de suivi de paroi pour minimiser les biais de l'investigateur.

• L'iontophorèse sera utilisée pour évaluer la fonction endothéliale microvasculaire par administration transdermique de médicament avec un courant électrique de faible intensité. Les participants s'acclimateront pendant 30 minutes dans une pièce maintenue à 23 °C avant de recevoir de l'acétylcholine (ACh, 1 %) et du nitroprussiate de sodium (SNP, 0,01 %) sur la face antérieure de l'avant-bras.
• La peau sera nettoyée avec de l'eau pour injection, et deux anneaux en plexiglas seront placés comme anode et cathode, connectés au contrôleur d'iontophorèse. Chaque chambre contiendra 0,5 mL de solution médicamenteuse. Le protocole de stimulation comprendra quatre impulsions à 25 µA, suivies d'impulsions uniques à 50, 100, 150 et 200 µA, chacune durant 20 secondes avec des intervalles de 120 secondes.
• Le flux sanguin cutané sera mesuré à l'aide de sondes Doppler laser connectées à un moniteur de perfusion, les données étant enregistrées via les logiciels PowerLab et LabChart. La conductance vasculaire cutanée (CVC) sera calculée comme flux cutané / PAM.

• Le débit cardiaque (CO) sera mesuré de manière non invasive à l'aide de l'appareil Physio Flow PF-05 Lab1 avec placement d'électrodes thoraciques. Deux électrodes placées au niveau du manubrium sternal et du thorax inférieur surveilleront l'ECG pour la fréquence cardiaque, tandis que quatre électrodes à la base du cou et au processus xiphoïde mesureront les signaux d'impédance.
• La peau sera préparée par rasage et nettoyage pour optimiser la qualité du signal. Pour les participants portant un stimulateur cardiaque, les électrodes cervicales seront positionnées à l'opposé de l'appareil. L'étalonnage sera effectué en acquérant des signaux stables sur 30 battements cardiaques avec mesure simultanée de la pression artérielle.
• Le système fournira la fréquence cardiaque, le volume d'éjection systolique, le CO et d'autres paramètres hémodynamiques, les données étant examinées et stockées pour analyse.

• La chimiluminescence à base d'ozone, un test biochimique, sera utilisée pour mesurer les métabolites de l'oxyde nitrique (NO), principalement le nitrite (NO₂⁻), dans les échantillons de salive. Dans cette méthode, le NO réagit avec l'ozone pour produire une forme excitée de dioxyde d'azote, qui est détectée comme un signal chimiluminescent.
• Les échantillons de salive seront analysés pour les concentrations de nitrite à l'aide d'un analyseur d'oxyde nitrique Sievers (Sievers NOA 280i).

• La chimiluminescence à base d'ozone, un test biochimique, sera utilisée pour mesurer les métabolites de l'oxyde nitrique (NO), tels que le nitrate (NO₃-), dans les échantillons de salive. Dans cette méthode, le NO réagit avec l'ozone pour produire une forme excitée de dioxyde d'azote, qui est détectée sous forme de signal chimiluminescent.
• Les échantillons de salive seront analysés pour les concentrations en nitrate à l'aide d'un analyseur d'oxyde nitrique Sievers (Sievers NOA 280i).

• La pression artérielle dans l'artère brachiale sera mesurée après 30 minutes de repos assis dans une pièce calme, à l'aide d'un sphygmomanomètre automatisé. Cinq lectures consécutives seront effectuées, avec un repos d'une minute entre chaque mesure.
• La moyenne de trois lectures sera enregistrée, incluant les valeurs moyennes pour la PAS, la PAD et la PAM.

• Les kits Duoset de dosage immuno-enzymatique ELISA seront utilisés pour quantifier les biomarqueurs sanguins, notamment l'IL-6, l'IL-10 et le TNFα, et pour évaluer l'inflammation systémique et son association avec la maladie parodontale et la fonction vasculaire. Les kits utilisent une approche ELISA sandwich, avec un anticorps de capture pré-enrobé sur une microplaque, suivi de l'application de l'échantillon.
• Cette méthode permet une mesure précise des cytokines et des protéines de la phase aiguë à partir des échantillons sanguins des participants. Une spécificité et une sensibilité élevées permettent la détection des marqueurs pro-inflammatoires (IL-6, TNFα) et anti-inflammatoires (IL-10). Les résultats fourniront des informations sur la réponse inflammatoire et sa modulation avant et après le traitement PMPR.

Pour évaluer et estimer l'efficacité de l'élimination mécanique de la plaque parodontale (PMPR) combinée à un bain de bouche à 0,2 % de CHX sur le saignement au sondage (BoP)

• Le BoP sera enregistré sur six sites par dent comme suit : 0 (minimum) = pas de saignement, 1 (maximum) = saignement au sondage.
• Les scores seront exprimés en pourcentage de sites saignants par participant, avec une plage minimale à maximale (0-100 %).
• Des scores plus bas indiquent un meilleur résultat parodontal ; une réduction reflète une amélioration suite au PMPR ± bain de bouche CHX.
• Ce résultat évaluera l'efficacité clinique à court terme du bain de bouche CHX en complément du PMPR chez les individus atteints de maladie parodontale.

Évaluer et estimer l'efficacité de l'élimination mécanique de la plaque parodontale (PMPR) associée à un bain de bouche à 0,2 % de CHX sur la profondeur de poche au sondage (PPD)

• La PPD sera mesurée en millimètres à six sites par dent et classée comme suit : 0 (minimum) = ≤3 mm, 1 = 4-5 mm, 2 (maximum) = ≥6 mm. Des scores plus bas indiquent un meilleur résultat parodontal. - L'efficacité sera évaluée comme le changement moyen de la PPD (mm) et comme le pourcentage de fermeture des poches, défini comme les sites avec une PPD initiale ≥4 mm réduite à ≤3 mm lors du suivi.
• Ce critère d'évaluation permettra d'évaluer l'efficacité clinique à court terme du bain de bouche CHX en complément de la PMPR chez les personnes atteintes de maladie parodontale.

Évaluer et estimer l'efficacité de l'Élimination Mécanique de la Plaque Parodontale (EMPP) associée à un bain de bouche à 0,2% de CHX sur le Niveau d'Attache Clinique (NAC)

• Le Niveau d'Attache Clinique (NAC) sera calculé en combinant les mesures de la profondeur de poche au sondage et de la récession gingivale.
• Le NAC sera mesuré en millimètres sur six sites par dent et classé comme suit : 0 (minimum) = 0-2 mm, 1 = 3-4 mm, 2 (maximum) = ≥5 mm.
• La variation moyenne du NAC (mm) sera ensuite comparée entre les deux groupes (EMPP + CHX vs. EMPP + placebo).
• Des scores plus bas indiquent un meilleur résultat parodontal ; une réduction reflète un gain d'attache après l'utilisation de l'EMPP ± bain de bouche CHX.
• Cet indice sera utilisé pour évaluer l'efficacité clinique à court terme du bain de bouche CHX, en complément de l'EMPP, chez les individus atteints de maladie parodontale.

Évaluer et estimer l'efficacité de l'élimination mécanique de la plaque parodontale (PMPR) combinée à un bain de bouche à 0,2% de CHX sur l'indice de plaque (IP).

• Un score de 0,1,2,3,4,5 sera utilisé pour enregistrer l'IP sur les surfaces buccales et linguales des dents (sauf les troisièmes molaires) en utilisant les critères de notation modifiés de Turesky.
• Système de notation :
• 0 (minimum) = Pas de plaque ; 1 = petites taches au niveau de la marge cervicale ; 2 = fine bande ≤1 mm ; 3 = bande >1 mm couvrant <⅓ de la surface ; 4 = plaque couvrant ≥⅓-<⅔ ; 5 (maximum) = plaque couvrant ≥⅔ de la surface.
• Les scores seront moyennés sur toutes les surfaces pour obtenir un score IP moyen allant du minimum au maximum, avec une plage de 0 à 5.
• Des scores plus bas indiquent une meilleure hygiène bucco-dentaire ; une réduction reflète une amélioration suite à la PMPR ± bain de bouche CHX.
• Cet indice sera utilisé pour évaluer l'efficacité clinique à court terme du bain de bouche CHX, en complément de la PMPR, chez les personnes atteintes de maladie parodontale.

Pour évaluer et mesurer l'efficacité de l'élimination mécanique de la plaque parodontale (PMPR) combinée à un bain de bouche à 0,2% de CHX sur l'indice gingival de Löe & Silness (GI).

• Le GI sera évalué sur quatre sites par dent (mésial, distal, vestibulaire, lingual) et noté (sur une échelle de 0 à 3 maximum) comme suit : 0 = normal, 1 = inflammation légère, 2 = inflammation modérée, 3 = inflammation sévère. Les scores seront moyennés sur tous les sites pour obtenir un score GI moyen (plage de 0 à 3). Des scores plus bas indiquent une meilleure santé gingivale ; une réduction reflète une amélioration suite au PMPR ± bain de bouche à 0,2% de CHX.
• Classification de la sévérité de la gingivite :
• Gingivite légère : 0,1-1,0 ; Gingivite modérée : 1,1-2,0 ; Sévère : 2,1-3,0
• Cet index sera utilisé pour évaluer l'efficacité clinique à court terme du bain de bouche CHX sur le GI, en complément du PMPR, chez les personnes atteintes de maladie parodontale.