miRNAは停留精巣と遊走精巣を区別するマーカーとして使用できるか (miRNA)

1. 導入 停留精巣（UDT）は最も一般的な先天性男性奇形であり、満期産児の1.0〜4.6％、早産児では最大45％に影響を及ぼす[1]。 UDTは先天性または後天性であり、先天性症例における自然下降は6か月以降まれである[2]。 1歳を超えて未治療のUDTは、間質線維症、精子形成の退化、および不妊リスクの増加につながる[3-5]。 さらに、未治療のUDTは精巣癌（TC）および精巣捻転（TT）のリスクを伴う。 これらの合併症を予防するためには、早期診断と治療が重要である。

   真の停留精巣（UDT）と移動性精巣（RT）を区別することは臨床的に困難である。 真のUDTは一貫して陰嚢が空で、精巣が下降しない状態を伴う。 対照的に、RTは自然に下降するか、手動で還納できるが、再上昇する可能性がある。 RTの治療は精巣が陰嚢外に留まる時間に依存する。 UDTをRTと誤診すると、治療の遅れと避けられない合併症のリスクがある。 したがって、UDTとRTを区別するための信頼できる指標が重要である。

   マイクロRNA（miRNA）は、転写後に遺伝子発現を調節する約22ヌクレオチドの非コードRNAである[6]。 miRNAは、様々な種において精子形成（SP）、初期胚発生、精子機能、および受精を調節することが知られている[7]。 真のUDTにおけるSPの障害が予想されることから、UDTとmiRNAの関係が探究されてきた。 研究により、UDTにおけるmiRNAレベルの変化が示されている：miR-210はアップレギュレーションされる[8]一方で、miR-449aおよびmiR-34cはダウンレギュレーションされる[9-11]。 重要なことに、移動性精巣（RT）症例におけるmiRNAの変化に関するデータは現在不足している。 理論的には、RTではSPは障害されないと予想される。したがって、SPの状態を反映するmiRNAの変化は、RTとUDTを区別し、手術対経過観察の決定を導く可能性がある。 本研究は、前向きにUDT、RT、および正常対照群間のmiRNA変化を比較した。

2. 材料と方法 2.1. サンプルサイズ 本研究は、UDT、RT、および正常対照群間のmiRNA変化を比較するための前向き比較試験として設計された。 サンプルサイズはG*Power 3.1.9.6により決定された。 3群を比較したmiR-34cの一元配置分散分析の検出力分析では、過去の研究[10]からの効果量（f=1.2955357）が用いられた。 99％の検出力と1％の誤差率を達成するためには、合計24のサンプルサイズが必要であった。 信頼性を高めるため、本研究では最終的に30人の患者を登録し、10人ずつ3群に分けた。

2.2. 患者集団 当初、当院泌尿器科クリニック（2022年3月から2023年3月の期間）から、停留精巣（UDT）の男児10人、移動性精巣（RT）の男児10人、および健康なボランティア（対照）10人が登録された。 しかし、採血のための親の拒否により、1人のRT患者と1人の対照患者が除外された。 触知可能な（片側または両側）UDT症例のみが含まれ、非触知型は除外された。 正確なRT診断を確保するため、初期の医師による検査は3体位（仰臥位、半仰臥位、立位）で実施され、その後1か月間の親による検査（1日2回）が行われた。 精巣が時間の50％以上を陰嚢内で過ごしたRT患者のみが含まれた。 除外基準には、既往の鼠径部／陰嚢手術、不完全なデータセット、または不適切な血清サンプルも含まれた。

2.3. 患者データと対照サンプルの収集 詳細な患者歴、身体検査、および定期的な生化学検査が実施された。 誤解釈を防ぐため、UDTの血液サンプルは手術前に採取された。 全群からの血液は5 mLの生化学用チューブに採取され、3000 rpmで10分間遠心分離された。 得られた粒子を含まない血清は1.5 mLチューブに移され、分析まで-80℃で保存された。

2.4. リアルタイムPCRによるmiR-210、miR-449a、miR-34cの発現レベルの検証 泌尿器科クリニックからの血清サンプルは、Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit（Zymo Research）によるRNA分離が行われた。 抽出されたmiRNAは、miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit（ABMGood）によりcDNAに逆転写された。 cDNAの品質と量は、リアルタイムPCR前にBioSpec-nano装置（島津製作所）を用いた分光光度法で評価された。 miRNA発現分析は、Rotor Gene Q（Qiagen）装置により実施された。 miR-210、miR-449a、およびmiR-34cのレベルは、すぐに使用できるプライマーとBlasTaq™ 2X qPCR MasterMix（ABMGood）を用いて定量された。

2.5. 統計解析 データの正規性はShapiro-Wilk検定により、分散の等質性はLevene検定により評価された。 記述統計は、パラメトリックデータについては平均±SD、ノンパラメトリックデータについては中央値（IQR）および平均（順位）として提示された。 群間比較では、パラメトリックデータには一元配置分散分析が、ノンパラメトリックデータにはクラスカル・ウォリス検定が用いられ、その後、事後多重比較のためにダン・ボンフェローニ補正が行われた。 相関分析にはスピアマンの順位相関係数が用いられた。 統計的有意性はp < 0.05に設定された。

miRNA発現は、Ct（交差点）値を介したqRT-PCRにより定量され、RNU6B_13で正規化された。 相対的miRNA発現レベルは、2-ΔCt法を用いて全群間で比較され、2Ct（目的遺伝子） - Ct（参照遺伝子）として計算された。 全ての統計解析はIBM SPSS v28（IBM Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国）を用いて実施された。