Poderão os miRNAs ser Utilizados como Marcadores para Distinguir Testículos não Descendidos de Testículos Retrácteis (miRNA)

1. Introdução Os testículos não descidos (TNDs) são a malformação congénita masculina mais comum, afetando 1,0-4,6% dos bebés de termo e até 45% dos bebés prematuros [1]. O TND pode ser congénito ou adquirido; a descida espontânea em casos congénitos é rara após os seis meses [2]. O TND não tratado após um ano de idade leva a fibrose intersticial, espermatogénese degenerada e aumento do risco de infertilidade [3-5]. Além disso, os TNDs não tratados apresentam riscos de cancro testicular (CT) e aumento da torção testicular (TT). O diagnóstico e tratamento precoces são cruciais para prevenir estas complicações.

   Diferenciar testículos verdadeiramente não descidos (TNDs) de testículos retrácteis (TRs) é clinicamente desafiador. O verdadeiro TND envolve um escroto consistentemente vazio, com os testículos nunca a descerem. Por outro lado, os TRs podem descer espontaneamente ou ser reduzidos manualmente, embora possam voltar a subir. O tratamento para TR depende do tempo passado fora do escroto. Diagnosticar erroneamente TND como TR arrisca atraso no tratamento e complicações inevitáveis. Assim, indicadores fiáveis para distinguir TNDs e TR são cruciais.

   Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes de ~22 nucleótidos que regulam a expressão genética pós-transcricionalmente [6]. Sabe-se que os miRNAs regulam a espermatogénese (SP), o desenvolvimento embrionário precoce, a função espermática e a fertilização em várias espécies [7]. Dada a esperada perturbação da SP em verdadeiros TNDs, a relação TND-miRNA tem sido explorada. Estudos mostraram níveis alterados de miRNA em TND: o miR-210 está aumentado [8], enquanto o miR-449a e o miR-34c estão diminuídos [9-11]. Criticamente, faltam atualmente dados sobre alterações de miRNA em casos de testículo retráctil (TR). Teoricamente, não se espera que a SP seja perturbada no TR. Assim, as alterações de miRNA, refletindo o estado da SP, poderiam diferenciar TR de TND, orientando decisões cirúrgicas versus de seguimento. Este estudo comparou prospectivamente alterações de miRNA entre grupos de TND, TR e controlo normal.

2. Materiais e métodos 2.1. Tamanho da amostra Este estudo está concebido como um ensaio controlado prospetivo para comparar alterações de miRNA entre grupos de TND, TR e controlo normal. O tamanho da amostra foi determinado através do G*Power 3.1.9.6. Uma análise de poder ANOVA unidirecional para o miR-34c, que comparou três grupos, utilizou um tamanho de efeito (f=1,2955357) de um estudo anterior [10]. Para atingir 99% de poder e uma taxa de erro de 1%, foi necessário um tamanho total de amostra de 24. Para aumentar a confiança, o estudo acabou por recrutar 30 doentes, que foram divididos em três grupos de 10.

2.2. População de doentes Inicialmente, foram recrutados 10 rapazes com testículos não descidos (TNDs), 10 com testículos retrácteis (TRs) e 10 voluntários saudáveis (controlos) da nossa clínica de urologia (datas entre março de 2022 e março de 2023). No entanto, um doente com TR e um doente controlo foram excluídos devido à recusa dos pais na colheita de sangue. Apenas foram incluídos casos de TND palpáveis (unilaterais ou bilaterais), excluindo tipos não palpáveis. Para garantir um diagnóstico preciso de TR, os exames médicos iniciais foram realizados em três posições (deitado, semideitado, de pé), seguidos de um exame parental de 1 mês (duas vezes por dia). Apenas foram incluídos doentes com TR cujos testículos passaram >50% do tempo no escroto. Os critérios de exclusão também incluíram cirurgia inguinal/escrotal prévia, conjuntos de dados defeituosos ou amostras de soro inadequadas.

2.3. Colheita de dados do doente e amostras de controlo Foram realizadas histórias clínicas detalhadas, exames físicos e testes bioquímicos de rotina. As amostras de sangue de TND foram colhidas antes da cirurgia para evitar interpretações erradas. O sangue de todos os grupos foi colhido em tubos de bioquímica de 5 mL e centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos. O soro resultante livre de partículas foi transferido para tubos de 1,5 mL e armazenado a -80°C até à análise.

2.4. Validação dos níveis de expressão de miR-210, miR-449a e miR-34c via PCR em tempo real As amostras de soro da clínica de urologia foram submetidas a isolamento de RNA através do Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). O miRNA extraído foi transcrito reversamente em cDNA através do miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). A qualidade e quantidade do cDNA foram avaliadas espectrofotometricamente com um instrumento BioSpec-nano (Shimadzu) antes do PCR em tempo real. A análise da expressão de miRNA foi realizada através de um instrumento Rotor Gene Q (Qiagen). Os níveis de miR-210, miR-449a e miR-34c foram quantificados com primers prontos a usar e BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Análise estatística A normalidade dos dados foi avaliada através do teste de Shapiro-Wilk, e a igualdade de variância foi avaliada através do teste de Levene. As estatísticas descritivas são apresentadas como médias ± DPs para dados paramétricos e medianas (IIQs) e médias (postos) para dados não paramétricos. Para comparações entre grupos, foi utilizada ANOVA unidirecional para dados paramétricos e o teste de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos, seguido da correção de Dunn-Bonferroni para comparações múltiplas post hoc. O coeficiente de correlação de postos de Spearman foi utilizado para analisar correlações. A significância estatística foi estabelecida em p < 0,05.

A expressão de miRNA foi quantificada via qRT-PCR através de valores Ct (ponto de cruzamento) e normalizada para RNU6B_13. Os níveis relativos de expressão de miRNA foram comparados entre todos os grupos através do método 2-ΔCt e calculados como 2Ct (gene alvo) - Ct (gene de referência). Todas as análises estatísticas foram realizadas através do IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, EUA).