Czy miRNA mogłyby być wykorzystane jako markery do różnicowania niezstąpionych jąder od jąder wędrujących (miRNA)

1. Wprowadzenie Niezstąpione jądra (UDT) są najczęstszą wrodzoną wadą męską, dotykającą 1,0–4,6% dzieci urodzonych o czasie i do 45% wcześniaków [1]. UDT może być wrodzone lub nabyte; samoistne zstąpienie w przypadkach wrodzonych jest rzadkie po sześciu miesiącach [2]. Nieleczone UDT po pierwszym roku życia prowadzi do zwłóknienia śródmiąższowego, degeneracji spermatogenezy i zwiększonego ryzyka niepłodności [3-5]. Ponadto nieleczone UDT niosą ze sobą ryzyko raka jądra (TC) i zwiększonego ryzyka skrętu jądra (TT). Wczesna diagnoza i leczenie są kluczowe dla zapobiegania tym powikłaniom.

   Różnicowanie prawdziwych niezstąpionych jąder (UDT) od jąder wędrujących (RT) jest klinicznie trudne. Prawdziwe UDT charakteryzuje się stale pustą moszną, przy czym jądra nigdy nie zstępują. Z kolei RT mogą samoistnie zstępować lub być ręcznie odprowadzone, chociaż mogą ponownie się wznosić. Leczenie RT zależy od czasu spędzonego poza moszną. Błędne rozpoznanie UDT jako RT grozi opóźnieniem leczenia i nieuniknionymi powikłaniami. Dlatego wiarygodne wskaźniki do rozróżniania UDT i RT są kluczowe.

   MikroRNA (miRNA) to niekodujące RNA o długości około 22 nukleotydów, które regulują ekspresję genów potranskrypcyjnie [6]. Wiadomo, że miRNA regulują spermatogenezę (SP), wczesny rozwój zarodkowy, funkcję plemników i zapłodnienie u różnych gatunków [7]. Biorąc pod uwagę oczekiwane zaburzenie SP w prawdziwych UDT, badano związek UDT-miRNA. Badania wykazały zmienione poziomy miRNA w UDT: miR-210 jest regulowany w górę [8], podczas gdy miR-449a i miR-34c są regulowane w dół [9-11]. Co istotne, obecnie brakuje danych na temat zmian miRNA w przypadkach jąder wędrujących (RT). Teoretycznie nie oczekuje się zaburzenia SP w RT. Zatem zmiany miRNA, odzwierciedlające stan SP, mogłyby różnicować RT od UDT, kierując decyzjami dotyczącymi leczenia operacyjnego a obserwacji. W tym badaniu porównano zmiany miRNA w grupach UDT, RT i kontrolnej normalnej prospektywnie.

2. Materiały i metody 2.1. Wielkość próby To badanie zostało zaprojektowane jako prospektywne badanie kontrolowane w celu porównania zmian miRNA w grupach UDT, RT i kontrolnej normalnej. Wielkość próby została określona za pomocą G*Power 3.1.9.6. Jednoczynnikowa analiza mocy ANOVA dla miR-34c, która porównywała trzy grupy, wykorzystała wielkość efektu (f=1,2955357) z poprzedniego badania [10]. Aby osiągnąć moc 99% i wskaźnik błędu 1%, potrzebna była całkowita wielkość próby 24. Aby zwiększyć pewność, badanie ostatecznie włączyło 30 pacjentów, którzy zostali podzieleni na trzy grupy po 10.

2.2. Populacja pacjentów Początkowo włączono 10 chłopców z niezstąpionymi jądrami (UDT), 10 z jądrami wędrującymi (RT) i 10 zdrowych ochotników (kontrola) z naszej kliniki urologicznej (daty między marcem 2022 a marcem 2023). Jednak jeden pacjent z RT i jeden pacjent kontrolny zostali wykluczeni z powodu odmowy rodziców pobrania krwi. Włączono tylko przypadki UDT wyczuwalne (jednostronne lub obustronne), wykluczając typy niewyczuwalne. Aby zapewnić dokładną diagnozę RT, wstępne badania lekarskie przeprowadzono w trzech pozycjach (leżąc na plecach, półleżąc, stojąc), a następnie miesięczne badanie przez rodziców (dwa razy dziennie). Włączono tylko pacjentów z RT, których jądra spędzały >50% czasu w mosznie. Kryteria wykluczenia obejmowały również wcześniejszą operację pachwinową/mosznową, wadliwe zestawy danych lub nieodpowiednie próbki surowicy.

2.3. Zbieranie danych pacjentów i próbek kontrolnych Przeprowadzono szczegółowe wywiady chorobowe, badania fizykalne i rutynowe testy biochemiczne. Próbki krwi UDT pobrano przed operacją, aby uniknąć błędnej interpretacji. Krew ze wszystkich grup pobrano do probówek biochemicznych 5 ml i odwirowano przy 3000 obr./min przez 10 minut. Otrzymaną wolną od cząstek surowicę przeniesiono do probówek 1,5 ml i przechowywano w -80°C do analizy.

2.4. Walidacja poziomów ekspresji miR-210, miR-449a i miR-34c za pomocą PCR w czasie rzeczywistym Próbki surowicy z kliniki urologicznej poddano izolacji RNA za pomocą zestawu Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Wyodrębnione miRNA odwrotnie transkrybowano do cDNA za pomocą zestawu miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). Jakość i ilość cDNA oceniono spektrofotometrycznie za pomocą przyrządu BioSpec-nano (Shimadzu) przed PCR w czasie rzeczywistym. Analizę ekspresji miRNA przeprowadzono za pomocą przyrządu Rotor Gene Q (Qiagen). Poziomy miR-210, miR-449a i miR-34c określono za pomocą gotowych starterów i BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Analiza statystyczna Normalność danych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka, a równość wariancji za pomocą testu Levene'a. Statystyki opisowe przedstawiono jako średnie ± SD dla danych parametrycznych oraz mediany (IQR) i średnie (rangi) dla danych nieparametrycznych. Do porównań międzygrupowych użyto jednoczynnikowej ANOVA dla danych parametrycznych i testu Kruskala-Wallisa dla danych nieparametrycznych, a następnie korekcji Dunn-Bonferroni dla wielokrotnych porównań post hoc. Do analizy korelacji użyto współczynnika korelacji rang Spearmana. Istotność statystyczną ustalono na p < 0,05.

Ekspresję miRNA określono ilościowo za pomocą qRT-PCR za pomocą wartości Ct (punktu przecięcia) i znormalizowano do RNU6B_13. Względne poziomy ekspresji miRNA porównano między wszystkimi grupami za pomocą metody 2-ΔCt i obliczono jako 2Ct (gen docelowy) - Ct (gen referencyjny). Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).