Könnten miRNAs als Marker zur Unterscheidung von nicht deszendierten Hoden von retraktilen Hoden verwendet werden? (miRNA)

1. Einleitung Nicht abgestiegene Hoden (UDTs) sind die häufigste angeborene Fehlbildung bei männlichen Säuglingen und betreffen 1,0-4,6 % der reifen Neugeborenen und bis zu 45 % der Frühgeborenen [1]. UDT kann angeboren oder erworben sein; ein spontanes Absteigen in angeborenen Fällen ist nach sechs Monaten selten [2]. Ein unbehandelter UDT nach dem ersten Lebensjahr führt zu interstitieller Fibrose, degenerierter Spermatogenese und einem erhöhten Risiko für Unfruchtbarkeit [3-5]. Darüber hinaus bergen unbehandelte UDTs Risiken für Hodenkrebs (TC) und ein erhöhtes Risiko für Hodentorsion (TT). Eine frühzeitige Diagnose und Behandlung sind entscheidend, um diese Komplikationen zu verhindern.

   Die Unterscheidung zwischen echten nicht abgestiegenen Hoden (UDTs) und retraktilen Hoden (RTs) ist klinisch schwierig. Bei einem echten UDT ist der Hodensack stets leer, und die Hoden steigen nie ab. Im Gegensatz dazu können RTs spontan absteigen oder manuell reponiert werden, obwohl sie wieder aufsteigen können. Die Behandlung von RT hängt von der Zeit außerhalb des Hodensacks ab. Eine Fehldiagnose von UDT als RT riskiert eine verzögerte Behandlung und unvermeidliche Komplikationen. Daher sind zuverlässige Indikatoren zur Unterscheidung von UDTs und RT entscheidend.

   MicroRNAs (miRNAs) sind ~22-Nukleotid lange nichtkodierende RNAs, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren [6]. Es ist bekannt, dass miRNAs die Spermatogenese (SP), die frühe Embryonalentwicklung, die Spermienfunktion und die Befruchtung bei verschiedenen Spezies regulieren [7]. Angesichts der zu erwartenden SP-Störung bei echten UDTs wurde die UDT-miRNA-Beziehung untersucht. Studien haben veränderte miRNA-Spiegel bei UDT gezeigt: miR-210 ist hochreguliert [8], während miR-449a und miR-34c herunterreguliert sind [9-11]. Kritisch ist, dass Daten zu miRNA-Veränderungen bei Fällen von retraktilen Hoden (RT) derzeit fehlen. Theoretisch wird bei RT keine SP-Störung erwartet. Daher könnten miRNA-Veränderungen, die den SP-Status widerspiegeln, RT von UDT unterscheiden und Entscheidungen zwischen chirurgischen Eingriffen und Nachbeobachtungen leiten. Diese Studie verglich prospektiv miRNA-Veränderungen zwischen UDT-, RT- und normalen Kontrollgruppen.

2. Materialien und Methoden 2.1. Stichprobengröße Diese Studie ist als prospektive kontrollierte Studie konzipiert, um miRNA-Veränderungen zwischen UDT-, RT- und normalen Kontrollgruppen zu vergleichen. Die Stichprobengröße wurde mit G*Power 3.1.9.6 bestimmt. Eine Einweg-ANOVA-Poweranalyse für miR-34c, die drei Gruppen verglich, nutzte eine Effektgröße (f=1,2955357) aus einer früheren Studie [10]. Um eine Power von 99 % und eine Fehlerrate von 1 % zu erreichen, war eine Gesamtstichprobengröße von 24 erforderlich. Um das Vertrauen zu erhöhen, wurden letztendlich 30 Patienten in die Studie aufgenommen, die in drei Gruppen zu je 10 eingeteilt wurden.

2.2. Patientenpopulation Ursprünglich wurden 10 Jungen mit nicht abgestiegenen Hoden (UDTs), 10 mit retraktilen Hoden (RTs) und 10 gesunde Freiwillige (Kontrollen) aus unserer urologischen Klinik (Zeitraum zwischen März 2022 und März 2023) eingeschlossen. Allerdings wurden ein RT-Patient und ein Kontrollpatient aufgrund der Verweigerung der Blutentnahme durch die Eltern ausgeschlossen. Es wurden nur palpable (einseitige oder beidseitige) UDT-Fälle eingeschlossen, nicht palpable Typen wurden ausgeschlossen. Um eine genaue RT-Diagnose zu gewährleisten, wurden zunächst ärztliche Untersuchungen in drei Positionen (Rückenlage, halbsitzende Position, Stehen) durchgeführt, gefolgt von einer 1-monatigen elterlichen Untersuchung (zweimal täglich). Nur RT-Patienten, deren Hoden >50 % der Zeit im Hodensack verbrachten, wurden eingeschlossen. Die Ausschlusskriterien umfassten auch frühere Leisten-/Hodensackoperationen, fehlerhafte Datensätze oder ungeeignete Serumproben.

2.3. Sammlung von Patientendaten und Kontrollproben Detaillierte Patientenanamnesen, körperliche Untersuchungen und routinemäßige biochemische Tests wurden durchgeführt. UDT-Blutproben wurden vor der Operation entnommen, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Blut aller Gruppen wurde in 5-ml-Biochemieröhrchen gesammelt und 10 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Das resultierende partikelfreie Serum wurde in 1,5-ml-Röhrchen überführt und bis zur Analyse bei -80°C gelagert.

2.4. Validierung der Expressionsniveaus von miR-210, miR-449a und miR-34c mittels Echtzeit-PCR Serumproben aus der urologischen Klinik wurden einer RNA-Isolierung mit dem Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research) unterzogen. Die extrahierte miRNA wurde mit dem miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood) in cDNA revers transkribiert. Die cDNA-Qualität und -Quantität wurde vor der Echtzeit-PCR spektrophotometrisch mit einem BioSpec-nano-Gerät (Shimadzu) bewertet. Die miRNA-Expressionsanalyse wurde mit einem Rotor Gene Q (Qiagen)-Gerät durchgeführt. Die Spiegel von miR-210, miR-449a und miR-34c wurden mit gebrauchsfertigen Primern und BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood) quantifiziert.

2.5. Statistische Analyse Die Datennormalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet, und die Varianzgleichheit wurde mit dem Levene-Test bewertet. Deskriptive Statistiken werden als Mittelwerte ± SDs für parametrische Daten und Mediane (IQRs) und Mittelwerte (Ränge) für nichtparametrische Daten dargestellt. Für Gruppenvergleiche wurde die Einweg-ANOVA für parametrische Daten und der Kruskal-Wallis-Test für nichtparametrische Daten verwendet, gefolgt von der Dunn-Bonferroni-Korrektur für post-hoc-Mehrfachvergleiche. Der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient wurde zur Analyse von Korrelationen verwendet. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Die miRNA-Expression wurde mittels qRT-PCR über Ct-Werte (crossing point) quantifiziert und auf RNU6B_13 normalisiert. Relative miRNA-Expressionsniveaus wurden zwischen allen Gruppen mit der 2-ΔCt-Methode verglichen und als 2Ct (Zielgen) - Ct (Referenzgen) berechnet. Alle statistischen Analysen wurden mit IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt.