miRNA能否作为区分隐睾与回缩性睾丸的标志物 (miRNA)

1. 引言 隐睾症是最常见的先天性男性畸形，影响1.0-4.6%的足月婴儿和高达45%的早产儿[1]。 隐睾症可以是先天性的或后天性的；先天性病例在六个月后自发下降的情况很少见[2]。 超过一岁未治疗的隐睾症会导致间质纤维化、生精功能退化以及不孕风险增加[3-5]。 此外，未经治疗的隐睾症还带有睾丸癌和睾丸扭转风险增高的风险。 早期诊断和治疗对于预防这些并发症至关重要。

   临床上区分真性隐睾症和可回缩睾丸具有挑战性。 真性隐睾症涉及持续空虚的阴囊，睾丸从未下降。 相反，可回缩睾丸可以自发下降或手动复位，尽管它们可能会重新上升。 可回缩睾丸的治疗取决于在阴囊外停留的时间。 将隐睾症误诊为可回缩睾丸会导致治疗延迟和不可避免的并发症。 因此，区分隐睾症和可回缩睾丸的可靠指标至关重要。

   微小RNA是约22个核苷酸的非编码RNA，在转录后调节基因表达[6]。 已知微小RNA调节多种物种的生精过程、早期胚胎发育、精子功能和受精[7]。 鉴于真性隐睾症中预期的生精过程破坏，已探索了隐睾症与微小RNA的关系。 研究表明隐睾症中微小RNA水平改变：miR-210上调[8]，而miR-449a和miR-34c下调[9-11]。 关键的是，目前缺乏关于可回缩睾丸病例中微小RNA变化的数据。 理论上，可回缩睾丸的生精过程预计不会受到破坏。因此，反映生精状态的微小RNA改变可能区分可回缩睾丸和隐睾症，指导手术与随访决策。 本研究前瞻性比较了隐睾症、可回缩睾丸和正常对照组的微小RNA变化。

2. 材料与方法 2.1. 样本量 本研究设计为前瞻性对照试验，比较隐睾症、可回缩睾丸和正常对照组的微小RNA变化。 样本量通过G*Power 3.1.9.6确定。 针对miR-34c的单因素方差分析功效分析（比较三组）使用了先前研究中的效应大小（f=1.2955357）[10]。 为达到99%的功效和1%的错误率，需要总样本量为24。 为增加置信度，研究最终招募了30名患者，分为三组，每组10人。

2.2. 患者人群 最初，招募了来自我们泌尿科诊所的10名隐睾症男孩、10名可回缩睾丸男孩和10名健康志愿者（对照组）（时间在2022年3月至2023年3月之间）。 然而，一名可回缩睾丸患者和一名对照患者因父母拒绝采血而被排除。 仅包括可触及（单侧或双侧）的隐睾症病例，排除不可触及类型。 为确保准确诊断可回缩睾丸，初始医生检查在三种体位（仰卧、半仰卧、站立）下进行，随后进行为期1个月的家长检查（每日两次）。 仅包括睾丸在阴囊内时间超过50%的可回缩睾丸患者。 排除标准还包括既往腹股沟/阴囊手术、数据缺陷或不合适的血清样本。

2.3. 患者数据和对照样本收集 进行了详细的病史、体格检查和常规生化测试。 隐睾症血液样本在手术前采集，以防止误解。 所有组的血液采集到5 mL生化管中，以3000 rpm离心10分钟。 所得无颗粒血清转移到1.5 mL管中，并在-80°C下储存直至分析。

2.4. 通过实时PCR验证miR-210、miR-449a和miR-34c的表达水平 泌尿科诊所的血清样本通过Quick-cfRNA™血清和血浆试剂盒（Zymo Research）进行RNA分离。 提取的微小RNA通过微小RNA全能cDNA合成试剂盒（ABMGood）逆转录为cDNA。 在实时PCR前，通过BioSpec-nano仪器（岛津）分光光度法评估cDNA质量和数量。 微小RNA表达分析通过Rotor Gene Q仪器（Qiagen）进行。 miR-210、miR-449a和miR-34c的水平使用即用型引物和BlasTaq™ 2X qPCR预混液（ABMGood）进行定量。

2.5. 统计分析 数据正态性通过Shapiro-Wilk检验评估，方差齐性通过Levene检验评估。 描述性统计以参数数据的均值±标准差和非参数数据的中位数（四分位距）和均值（秩）呈现。 对于组间比较，参数数据使用单因素方差分析，非参数数据使用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn-Bonferroni校正进行事后多重比较。 使用Spearman秩相关系数分析相关性。 统计显著性设定为p < 0.05。

微小RNA表达通过qRT-PCR通过Ct（交叉点）值进行定量，并标准化为RNU6B_13。 相对微小RNA表达水平通过2-ΔCt方法在所有组间比较，计算为2Ct（靶基因）- Ct（参考基因）。 所有统计分析通过IBM SPSS v28（IBM Inc., Chicago, IL, USA）进行。