Могут ли миРНК использоваться в качестве маркеров для различения неопустившихся яичек от ретрактильных яичек (miRNA)

1. Введение Неопущение яичек (НОЯ) является наиболее распространенной врожденной аномалией у мальчиков, затрагивая 1,0–4,6% доношенных младенцев и до 45% недоношенных младенцев [1]. НОЯ может быть врожденным или приобретенным; спонтанное опущение при врожденных случаях редко происходит после шести месяцев [2]. Нелеченное НОЯ в возрасте старше одного года приводит к интерстициальному фиброзу, дегенерации сперматогенеза и повышенному риску бесплодия [3–5]. Более того, нелеченное НОЯ несет риски развития рака яичка (РЯ) и повышенного риска перекрута яичка (ПЯ). Ранняя диагностика и лечение имеют решающее значение для предотвращения этих осложнений.

   Клинически сложно дифференцировать истинное неопущение яичек (НОЯ) от ретрактильных яичек (РЯ). Истинное НОЯ характеризуется постоянно пустой мошонкой, при этом яички никогда не опускаются. Напротив, РЯ могут спонтанно опускаться или быть вправлены вручную, хотя они могут снова подниматься. Лечение РЯ зависит от времени, проведенного вне мошонки. Ошибочная диагностика НОЯ как РЯ грозит задержкой лечения и неизбежными осложнениями. Таким образом, надежные показатели для различения НОЯ и РЯ имеют решающее значение.

   МикроРНК (миРНК) представляют собой некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию генов [6]. Известно, что миРНК регулируют сперматогенез (СП), раннее эмбриональное развитие, функцию сперматозоидов и оплодотворение у различных видов [7]. Учитывая ожидаемое нарушение СП при истинном НОЯ, изучалась взаимосвязь НОЯ и миРНК. Исследования показали измененные уровни миРНК при НОЯ: миР-210 повышена [8], тогда как миР-449a и миР-34c понижены [9–11]. Критически важно, что данные об изменениях миРНК в случаях ретрактильных яичек (РЯ) в настоящее время отсутствуют. Теоретически, СП при РЯ не должен нарушаться. Таким образом, изменения миРНК, отражающие статус СП, могли бы дифференцировать РЯ от НОЯ, направляя решения в пользу хирургического вмешательства или наблюдения. Данное исследование проспективно сравнивало изменения миРНК в группах НОЯ, РЯ и нормального контроля.

2. Материалы и методы 2.1. Размер выборки Данное исследование спроектировано как проспективное контролируемое испытание для сравнения изменений миРНК в группах НОЯ, РЯ и нормального контроля. Размер выборки был определен с помощью G*Power 3.1.9.6. Анализ мощности однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для миР-34c, который сравнивал три группы, использовал размер эффекта (f=1,2955357) из предыдущего исследования [10]. Для достижения мощности 99% и уровня ошибки 1% требовался общий размер выборки 24. Для повышения достоверности исследование в конечном итоге включило 30 пациентов, которые были разделены на три группы по 10 человек.

2.2. Популяция пациентов Изначально были включены 10 мальчиков с неопущением яичек (НОЯ), 10 с ретрактильными яичками (РЯ) и 10 здоровых добровольцев (контроль) из нашей урологической клиники (в период с марта 2022 по март 2023 года). Однако один пациент с РЯ и один контрольный пациент были исключены из-за отказа родителей от забора крови. Включались только пальпируемые (односторонние или двусторонние) случаи НОЯ, исключая непальпируемые типы. Для обеспечения точной диагностики РЯ первоначальные врачебные осмотры проводились в трех положениях (лежа на спине, полулежа, стоя), после чего следовало 1-месячное обследование родителями (дважды в день). Включались только пациенты с РЯ, чьи яички проводили >50% времени в мошонке. Критерии исключения также включали предшествующие операции на паховой области/мошонке, дефектные наборы данных или неподходящие образцы сыворотки.

2.3. Сбор данных пациентов и контрольных образцов Были проведены подробный сбор анамнеза пациентов, физикальные обследования и рутинные биохимические тесты. Образцы крови при НОЯ собирались до операции, чтобы избежать неверной интерпретации. Кровь из всех групп собиралась в биохимические пробирки объемом 5 мл и центрифугировалась при 3000 об/мин в течение 10 минут. Полученная сыворотка, свободная от частиц, переносилась в пробирки объемом 1,5 мл и хранилась при -80°C до анализа.

2.4. Валидация уровней экспрессии миР-210, миР-449a и миР-34c с помощью ПЦР в реальном времени Образцы сыворотки из урологической клиники подвергались выделению РНК с помощью набора Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Выделенная миРНК обратно транскрибировалась в кДНК с помощью набора miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). Качество и количество кДНК оценивались спектрофотометрически с помощью прибора BioSpec-nano (Shimadzu) перед ПЦР в реальном времени. Анализ экспрессии миРНК проводился с помощью прибора Rotor Gene Q (Qiagen). Уровни миР-210, миР-449a и миР-34c количественно определялись с помощью готовых к использованию праймеров и BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Статистический анализ Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, а равенство дисперсий – с помощью теста Левена. Описательная статистика представлена как средние значения ± стандартные отклонения для параметрических данных и медианы (межквартильные размахи) и средние (ранги) для непараметрических данных. Для сравнения групп использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для параметрических данных и критерий Краскела-Уоллиса для непараметрических данных с последующей поправкой Данна-Бонферрони для пост-фактум множественных сравнений. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена использовался для анализа корреляций. Статистическая значимость устанавливалась при p < 0,05.

Экспрессия миРНК количественно определялась с помощью кПЦР в реальном времени через значения Ct (точка пересечения) и нормализовалась к RNU6B_13. Относительные уровни экспрессии миРНК сравнивались между всеми группами с помощью метода 2-ΔCt и рассчитывались как 2Ct (целевой ген) - Ct (референсный ген). Все статистические анализы были выполнены с помощью IBM SPSS v28 (IBM Inc., Чикаго, Иллинойс, США).