Kunne miRNA'er bruges som markører til at skelne mellem ikke-nedstegne testikler og retraherende testikler (miRNA)

1. Introduktion Ikke-nedsunkne testikler (UDT'er) er den mest almindelige medfødte misdannelse hos drenge, som rammer 1,0-4,6% af børn født til termin og op til 45% af for tidligt fødte børn [1]. UDT kan være medfødt eller erhvervet; spontan nedstigning i medfødte tilfælde er sjælden efter seks måneder [2]. Ubehandlet UDT efter et års alder fører til interstitiel fibrose, degenereret spermatogenese og øget risiko for infertilitet [3-5]. Desuden indebærer ubehandlede UDT'er risiko for testikelcancer (TC) og forhøjet risiko for testikeltorsion (TT). Tidlig diagnose og behandling er afgørende for at forebygge disse komplikationer.

   At skelne mellem ægte ikke-nedsunkne testikler (UDT'er) og retraktile testikler (RT'er) er klinisk udfordrende. Ægte UDT involverer en konsekvent tom skrotum, hvor testiklerne aldrig nedsynker. Omvendt kan RT'er spontant nedsynke eller manuelt reduceres, selvom de kan stige op igen. Behandling for RT afhænger af den tid, der tilbringes uden for skrotum. Fejldiagnosticering af UDT som RT risikerer forsinket behandling og uundgåelige komplikationer. Derfor er pålidelige indikatorer til at skelne mellem UDT'er og RT afgørende.

   MicroRNA (miRNA'er) er ~22-nukleotid ikke-kodende RNA'er, der posttranskriptionelt regulerer genekspression [6]. MiRNA'er er kendt for at regulere spermatogenese (SP), tidlig embryonal udvikling, sædfunktion og befrugtning i forskellige arter [7]. I betragtning af den forventede SP-forstyrrelse i ægte UDT'er, er forholdet mellem UDT-miRNA blevet udforsket. Studier har vist ændrede miRNA-niveauer i UDT: miR-210 er opreguleret [8], hvorimod miR-449a og miR-34c er nedreguleret [9-11]. Kritisk set mangler der i øjeblikket data om miRNA-ændringer i tilfælde af retraktile testikler (RT). Teoretisk forventes SP ikke at være forstyrret ved RT. Således kunne miRNA-ændringer, der afspejler SP-status, skelne RT fra UDT og guide beslutninger om kirurgi versus opfølgning. Dette studie sammenlignede miRNA-ændringer på tværs af UDT-, RT- og normale kontrolgrupper prospektivt.

2. Materialer og metoder 2.1. Stikprøvestørrelse Dette studie er designet som et prospektivt kontrolleret forsøg til at sammenligne miRNA-ændringer på tværs af UDT-, RT- og normale kontrolgrupper. Stikprøvestørrelsen blev bestemt via G*Power 3.1.9.6. En envejs ANOVA styrkeanalyse for miR-34c, der sammenlignede tre grupper, anvendte en effektstørrelse (f=1,2955357) fra et tidligere studie [10]. For at opnå 99% styrke og en 1% fejlrate var en samlet stikprøvestørrelse på 24 nødvendig. For at øge tilliden inkluderede studiet i sidste ende 30 patienter, der blev opdelt i tre grupper af 10.

2.2. Patientpopulation Oprindeligt blev 10 drenge med ikke-nedsunkne testikler (UDT'er), 10 med retraktile testikler (RT'er) og 10 raske frivillige (kontroller) fra vores urologiklinik (datoer mellem marts 2022 og marts 2023) inkluderet. Dog blev en RT-patient og en kontrolpatient ekskluderet på grund af forældrenes afslag på blodprøvetagning. Kun palpabel (unilateral eller bilateral) UDT-tilfælde blev inkluderet, hvilket udelukker ikke-palpable typer. For at sikre nøjagtig RT-diagnose blev indledende lægeundersøgelser udført i tre positioner (ryglægende, halvryglægende, stående), efterfulgt af en 1-månedlig forældreundersøgelse (to gange dagligt). Kun RT-patienter, hvis testikler tilbragte >50% af deres tid i skrotum, blev inkluderet. Eksklusionskriterierne omfattede også tidligere lyske-/skrotalkirurgi, defekte datasæt eller uegnede serumprøver.

2.3. Indsamling af patientdata og kontrolprøver Detaljerede patienthistorier, fysiske undersøgelser og rutinemæssige biokemiske tests blev udført. UDT-blodprøver blev indsamlet før operation for at undgå fejltolkning. Blod fra alle grupper blev indsamlet i 5 mL biokemirør og centrifugeret ved 3000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter. Det resulterende partikelfrie serum blev overført til 1,5 mL rør og opbevaret ved -80°C indtil analyse.

2.4. Validering af ekspressionsniveauerne for miR-210, miR-449a og miR-34c via realtids PCR Serumprøver fra urologiklinikken blev udsat for RNA-isolering via Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Den ekstraherede miRNA blev revers transskriberet til cDNA via miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). cDNA-kvalitet og -kvantitet blev vurderet spektrofotometrisk med et BioSpec-nano instrument (Shimadzu) før realtids PCR. MiRNA-ekspressionsanalyse blev udført via et Rotor Gene Q (Qiagen) instrument. Niveauerne af miR-210, miR-449a og miR-34c blev kvantificeret med klar-til-brug-primere og BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Statistisk analyse Datanormalitet blev vurderet via Shapiro-Wilk testen, og varianslighed blev vurderet via Levenes test. Beskrivende statistik præsenteres som middelværdier ± SD'er for parametriske data og medianer (IQR'er) og middelværdier (rækker) for ikke-parametriske data. Til gruppesammenligninger blev envejs ANOVA brugt for parametriske data, og Kruskal-Wallis testen blev brugt for ikke-parametriske data, efterfulgt af Dunn-Bonferroni korrektion for post hoc multiple sammenligninger. Spearmans rangkorrelationskoefficient blev brugt til at analysere korrelationer. Statistisk signifikans blev sat til p < 0,05.

MiRNA-ekspression blev kvantificeret via qRT-PCR via Ct (krydningspunkt) værdier og normaliseret til RNU6B_13. Relative miRNA-ekspressionsniveauer blev sammenlignet blandt alle grupper via 2-ΔCt metoden og beregnet som 2Ct (målgene) - Ct (referencegene). Alle de statistiske analyser blev udført via IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).