Mohly by být miRNA použity jako markery pro rozlišení nesestouplých varlat od retraktilních varlat? (miRNA)

1. Úvod Nesestouplá varlata (UDT) jsou nejčastější vrozenou malformací u mužů, postihující 1,0–4,6 % dětí narozených v termínu a až 45 % předčasně narozených dětí [1]. UDT mohou být vrozená nebo získaná; spontánní sestup u vrozených případů je po šesti měsících vzácný [2]. Neléčená UDT po prvním roce věku vede k intersticiální fibróze, degeneraci spermatogeneze a zvýšenému riziku neplodnosti [3-5]. Navíc neléčená UDT nesou rizika vzniku rakoviny varlat (TC) a zvýšeného riziko torze varlete (TT). Včasná diagnóza a léčba jsou klíčové pro prevenci těchto komplikací.

   Rozlišení skutečně nesestouplých varlat (UDT) od retraktilních varlat (RT) je klinicky náročné. Pravá UDT zahrnuje trvale prázdný šourek, s varlaty, která nikdy nesestoupí. Naopak RT se mohou spontánně sestoupit nebo být manuálně reponována, ačkoli mohou opět vystoupit. Léčba RT závisí na čase stráveném mimo šourek. Chybná diagnóza UDT jako RT riskuje opožděnou léčbu a nevyhnutelné komplikace. Proto jsou spolehlivé ukazatele pro rozlišení UDT a RT klíčové.

   MikroRNA (miRNA) jsou ~22-nukleotidové nekódující RNA, které posttranskripčně regulují genovou expresi [6]. Je známo, že miRNA regulují spermatogenezi (SP), raný embryonální vývoj, funkci spermií a oplodnění u různých druhů [7]. Vzhledem k očekávanému narušení SP u pravých UDT byl prozkoumán vztah UDT-miRNA. Studie ukázaly změněné hladiny miRNA u UDT: miR-210 je zvýšena [8], zatímco miR-449a a miR-34c jsou sníženy [9-11]. Kriticky, data o změnách miRNA v případech retraktilních varlat (RT) v současnosti chybí. Teoreticky se u RT neočekává narušení SP. Tudíž změny miRNA, odrážející stav SP, by mohly odlišit RT od UDT, což by vedlo rozhodnutí mezi chirurgickým zákrokem a sledováním. Tato studie prospektivně porovnávala změny miRNA mezi skupinami UDT, RT a normální kontroly.

2. Materiály a metody 2.1. Velikost vzorku Tato studie je navržena jako prospektivní kontrolovaná studie pro porovnání změn miRNA mezi skupinami UDT, RT a normální kontroly. Velikost vzorku byla stanovena pomocí G*Power 3.1.9.6. Jednosměrná ANOVA analýza síly pro miR-34c, která porovnávala tři skupiny, využila velikost účinku (f=1,2955357) z předchozí studie [10]. Pro dosažení 99% síly a 1% chybovosti byla potřebná celková velikost vzorku 24. Pro zvýšení spolehlivosti studie bylo nakonec zařazeno 30 pacientů, rozdělených do tří skupin po 10.

2.2. Populace pacientů Zpočátku bylo zařazeno 10 chlapců s nesestouplými varlaty (UDT), 10 s retraktilními varlaty (RT) a 10 zdravých dobrovolníků (kontroly) z naší urologické kliniky (data mezi březnem 2022 a březnem 2023). Avšak jeden pacient s RT a jeden kontrolní pacient byli vyloučeni kvůli odmítnutí odběru krve rodiči. Byly zahrnuty pouze hmatné (jednostranné nebo oboustranné) případy UDT, s vyloučením nehmatných typů. Pro zajištění přesné diagnózy RT byly provedeny počáteční vyšetření lékařem ve třech polohách (vleže, pololeže, stoje), následované 1měsíčním vyšetřením rodiči (dvakrát denně). Byli zahrnuti pouze pacienti s RT, jejichž varlata strávila >50 % času v šourku. Vylučovací kritéria také zahrnovala předchozí operaci v třísle/šourku, vadné datové sady nebo nevhodné vzorky séra.

2.3. Sběr pacientských dat a kontrolních vzorků Byly provedeny podrobné anamnézy pacientů, fyzikální vyšetření a rutinní biochemické testy. Vzorky krve UDT byly odebrány před operací, aby se předešlo nesprávné interpretaci. Krev ze všech skupin byla odebrána do 5 ml biochemických zkumavek a centrifugována při 3000 ot./min po dobu 10 minut. Výsledné bezčásticové sérum bylo přeneseno do 1,5 ml zkumavek a skladováno při -80 °C do analýzy.

2.4. Validace expresních hladin miR-210, miR-449a a miR-34c pomocí real-time PCR Vzorky séra z urologické kliniky byly podrobeny izolaci RNA pomocí sady Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Extrahovaná miRNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí sady miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). Kvalita a množství cDNA byly před real-time PCR hodnoceny spektrofotometricky přístrojem BioSpec-nano (Shimadzu). Analýza exprese miRNA byla provedena pomocí přístroje Rotor Gene Q (Qiagen). Hladiny miR-210, miR-449a a miR-34c byly kvantifikovány pomocí hotových primerů a BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Statistická analýza Normalita dat byla hodnocena pomocí Shapiro-Wilkova testu a rovnost rozptylů pomocí Leveneova testu. Deskriptivní statistika je prezentována jako průměry ± SD pro parametrická data a mediány (IQR) a průměry (pořadí) pro neparametrická data. Pro porovnání skupin byla použita jednosměrná ANOVA pro parametrická data a Kruskal-Wallisův test pro neparametrická data, následovaná Dunn-Bonferroniho korekcí pro post hoc vícenásobná porovnání. Spearmanův korelační koeficient pořadí byl použit k analýze korelací. Statistická významnost byla stanovena na p < 0,05.

Exprese miRNA byla kvantifikována pomocí qRT-PCR prostřednictvím hodnot Ct (bodu křížení) a normalizována na RNU6B_13. Relativní expresní hladiny miRNA byly porovnány mezi všemi skupinami pomocí metody 2-ΔCt a vypočteny jako 2Ct (cílový gen) - Ct (referenční gen). Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).