Kan miRNA användas som markörer för att skilja mellan ofullständigt nedstigna testiklar och retraktila testiklar (miRNA)

1. Introduktion Ej nedstigna testiklar (UDT) är den vanligaste medfödda missbildningen hos pojkar, som drabbar 1,0–4,6 % av fullgångna nyfödda och upp till 45 % av för tidigt födda barn [1]. UDT kan vara medfött eller förvärvat; spontan nedstigning i medfödda fall är sällsynt efter sex månader [2]. Obearbetad UDT efter ett års ålder leder till interstitiell fibros, degenererad spermatogenes och ökad infertilitetsrisk [3–5]. Dessutom bär obearbetade UDT risker för testikelcancer (TC) och ökad risk för testikeltorsion (TT). Tidig diagnos och behandling är avgörande för att förhindra dessa komplikationer.

   Att skilja äkta ej nedstigna testiklar (UDT) från retraktila testiklar (RT) är kliniskt utmanande. Äkta UDT innebär en konsekvent tom scrotum, där testiklarna aldrig nedstiger. Däremot kan RT spontant nedstiga eller manuellt reduceras, även om de kan återstiga. Behandling för RT beror på tiden utanför scrotum. Felaktig diagnos av UDT som RT riskerar fördröjd behandling och oundvikliga komplikationer. Därför är tillförlitliga indikatorer för att skilja UDT och RT avgörande.

   MicroRNA (miRNA) är ~22-nukleotid långa icke-kodande RNA som reglerar genuttryck posttranskriptionellt [6]. MiRNA är kända för att reglera spermatogenes (SP), tidig embryoutveckling, spermiefunktion och befruktning i olika arter [7]. Med tanke på den förväntade SP-störningen i äkta UDT har förhållandet mellan UDT och miRNA undersökts. Studier har visat förändrade miRNA-nivåer i UDT: miR-210 är uppreglerad [8], medan miR-449a och miR-34c är nedreglerade [9–11]. Kritiskt är att data om miRNA-förändringar i retraktila testikel (RT) fall för närvarande saknas. Teoretiskt förväntas inte SP vara störd vid RT. Således kan miRNA-förändringar, som speglar SP-status, skilja RT från UDT och vägleda beslut om kirurgi kontinuerlig uppföljning. Denna studie jämförde miRNA-förändringar över UDT-, RT- och normala kontrollgrupper prospektivt.

2. Material och metoder 2.1. Urvalsstorlek Denna studie är utformad som en prospektiv kontrollerad studie för att jämföra miRNA-förändringar över UDT-, RT- och normala kontrollgrupper. Urvalsstorleken bestämdes via G*Power 3.1.9.6. En envägs ANOVA-kraftanalys för miR-34c, som jämförde tre grupper, använde en effektstorlek (f=1,2955357) från en tidigare studie [10]. För att uppnå 99 % kraft och en 1 % felkvot behövdes en total urvalsstorlek på 24. För att öka tillförlitligheten rekryterade studien slutligen 30 patienter, som delades in i tre grupper om 10.

2.2. Patientpopulation Initialt rekryterades 10 pojkar med ej nedstigna testiklar (UDT), 10 med retraktila testiklar (RT) och 10 friska volontärer (kontroller) från vår urologiklinik (perioden mars 2022 till mars 2023). En RT-patient och en kontrollpatient exkluderades dock på grund av föräldrars vägran till blodprovstagning. Endast palperbara (unilaterala eller bilaterala) UDT-fall inkluderades, med uteslutning av icke-palperbara typer. För att säkerställa korrekt RT-diagnos utfördes initiala läkarundersökningar i tre positioner (ryggläge, halvryggläge, stående), följt av en 1-månaders föräldraundersökning (två gånger dagligen). Endast RT-patienter vars testiklar tillbringade >50 % av tiden i scrotum inkluderades. Exklusionskriterierna inkluderade också tidigare ljumsk-/scrotalkirurgi, defekta dataset eller olämpliga serumprover.

2.3. Insamling av patientdata och kontrollprover Detaljerade patienthistorier, fysiska undersökningar och rutinbiokemiska tester utfördes. UDT-blodprover samlades in före operation för att undvika feltolkning. Blod från alla grupper samlades i 5 ml biokemitubor och centrifugerades vid 3000 rpm i 10 minuter. Det resulterande partikelfria serumet överfördes till 1,5 ml tubor och förvarades vid -80 °C till analys.

2.4. Validering av uttrycksnivåer för miR-210, miR-449a och miR-34c via realtids-PCR Serumprover från urologikliniken utsattes för RNA-isolering via Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Det extraherade miRNA omvandlades revers till cDNA via miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). cDNA-kvalitet och kvantitet bedömdes spektrofotometriskt med ett BioSpec-nano-instrument (Shimadzu) före realtids-PCR. MiRNA-uttrycksanalys utfördes via ett Rotor Gene Q-instrument (Qiagen). Nivåerna av miR-210, miR-449a och miR-34c kvantifierades med färdiga primer och BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Statistisk analys Datanormalitet bedömdes via Shapiro-Wilk-testet, och varianslikhet bedömdes via Levenes test. Beskrivande statistik presenteras som medelvärden ± SD för parametriska data och medianer (IQR) och medelvärden (rang) för icke-parametriska data. För gruppjämförelser användes envägs ANOVA för parametriska data och Kruskal-Wallis-test för icke-parametriska data, följt av Dunn-Bonferroni-korrigering för post hoc multipla jämförelser. Spearmans rangkorrelationskoefficient användes för att analysera korrelationer. Statistisk signifikans sattes till p < 0,05.

MiRNA-uttryck kvantifierades via qRT-PCR via Ct-värden (korsningspunkt) och normaliserades till RNU6B_13. Relativa miRNA-uttrycksnivåer jämfördes mellan alla grupper via 2-ΔCt-metoden och beräknades som 2Ct (målgen) - Ct (referensgen). Alla statistiska analyser utfördes via IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).