Voisivatko miRNA:t toimia merkkiaineina kivespussin ulkopuolella pysyvien kivesten ja vetäytyvien kivesten erottamisessa (miRNA)

1. Johdanto Laskeutumattomat kivekset (UDT) ovat yleisin synnynnäinen miespuolinen epämuodostuma, joka vaikuttaa 1,0–4,6 % täysiaikaisista vastasyntyneistä ja jopa 45 % ennenaikaisesti syntyneistä vastasyntyneistä [1]. UDT voi olla synnynnäinen tai hankittu; spontaani laskeutuminen synnynnäisissä tapauksissa on harvinaista kuuden kuukauden jälkeen [2]. Hoitamaton UDT yli vuoden iässä johtaa interstisiaaliseen fibroosiin, degeneroituneeseen spermatogeneesiin ja lisääntyneeseen hedelmättömyysriskiin [3-5]. Lisäksi hoitamattomat UDT:t kantavat riskejä kiveskasvaimesta (TC) ja lisääntyneestä kiveskiertymästä (TT). Varhainen diagnosointi ja hoito ovat ratkaisevan tärkeitä näiden komplikaatioiden estämiseksi.

   Todellisten laskeutumattomien kivesten (UDT) erottaminen vetäytyvistä kivistä (RT) on kliinisesti haastavaa. Todellinen UDT sisältää jatkuvasti tyhjän kivespussin, jossa kivekset eivät koskaan laskeudu. Vastakkaisesti RT:t voivat spontaanisti laskeutua tai manuaalisesti palautua, vaikka ne voivatkin nousta uudelleen. RT:n hoito riippuu ajasta, joka vietetään kivespussin ulkopuolella. UDT:n virheellinen diagnosointi RT:ksi riskeeraa viivästyneen hoidon ja väistämättömät komplikaatiot. Siten luotettavat indikaattorit UDT:iden ja RT:n erottamiseksi ovat ratkaisevan tärkeitä.

   MicroRNA:t (miRNA) ovat noin 22-nukleotidisia ei-koodaavia RNA:ita, jotka posttranskriptionaalisesti säätelevät geenien ilmentymistä [6]. MiRNA:ten tiedetään säätelevän spermatogeneesia (SP), varhaista alkionkehitystä, siittiöiden toimintaa ja hedelmöitystä eri lajeissa [7]. Odotetun SP:n häiriintymisen vuoksi todellisissa UDT:issä UDT-miRNA-suhdetta on tutkittu. Tutkimukset ovat osoittaneet muuttuneita miRNA-tasoja UDT:ssä: miR-210 on ylireguloitunut [8], kun taas miR-449a ja miR-34c ovat alireguloituneita [9-11]. Kriittisesti, tietoja miRNA-muutoksista vetäytyvän kiveksen (RT) tapauksissa ei tällä hetkellä ole saatavilla. Teoreettisesti SP:ta ei odoteta häiriintyvän RT:ssä. Siten miRNA-muutokset, jotka heijastavat SP:n tilaa, voisivat erottaa RT:n UDT:sta, ohjaten kirurgisia versus seurantapäätöksiä. Tämä tutkimus vertaili miRNA-muutoksia UDT-, RT- ja normaali kontrolliryhmien välillä prospektiivisesti.

2. Materiaalit ja menetelmät 2.1. Otoskoko Tämä tutkimus on suunniteltu prospektiiviseksi kontrolloiduksi kokeeksi miRNA-muutosten vertailemiseksi UDT-, RT- ja normaali kontrolliryhmien välillä. Otoskoko määritettiin G*Power 3.1.9.6:n avulla. Yksisuuntainen ANOVA-tehoanalyysi miR-34c:lle, joka vertaili kolmea ryhmää, käytti efekti kokoa (f=1,2955357) aiemmasta tutkimuksesta [10]. 99 % tehon saavuttamiseksi ja 1 % virheprosentin saavuttamiseksi tarvittiin yhteensä 24:n otoskoko. Luottamuksen lisäämiseksi tutkimukseen lopulta rekrytoitiin 30 potilasta, jotka jaettiin kolmeen 10 henkilön ryhmään.

2.2. Potilasväestö Aluksi 10 poikaa laskeutumattomilla kiviksillä (UDT), 10 vetäytyvillä kiviksillä (RT) ja 10 terveellä vapaaehtoisella (kontrollit) meidän urologian klinikalta (päivät maaliskuun 2022 ja maaliskuun 2023 välillä) rekrytoitiin. Kuitenkin yksi RT-potilas ja yksi kontrollipotilas suljettiin pois vanhempien kieltäydyttyä verinäytteenotosta. Vain tunnusteltavat (yksipuoliset tai kaksipuoliset) UDT-tapaukset sisällytettiin, pois sulkemalla tunnustamattomat tyypit. Tarkan RT-diagnoosin varmistamiseksi alkuperäiset lääkärintarkastukset suoritettiin kolmessa asennossa (makuulla, puolimakuulla, seisaaltaan), jota seurasi 1 kuukauden vanhempien tarkastus (kahdesti päivässä). Vain RT-potilaat, joiden kivekset viettivät >50 % ajastaan kivespussissa, sisällytettiin. Pois sulkemiskriteerit sisälsivät myös aiemman nivus-/kivespussi leikkauksen, puutteelliset tietojoukot tai sopimattomat seeruminäytteet.

2.3. Potilastietojen ja kontrollinäytteiden kerääminen Yksityiskohtaiset potilashistoriat, fyysiset tutkimukset ja rutiinibio kemialliset testit suoritettiin. UDT-verinäytteet kerättiin ennen leikkausta väärintulkinnan estämiseksi. Veri kaikista ryhmistä kerättiin 5 ml biokemian putkiin ja sentrifugoitiin 3000 rpm:llä 10 minuutin ajan. Tuloksena saatu hiukkaseton seerumi siirrettiin 1,5 ml putkiin ja varastoitiin -80°C:seen analyysiin asti.

2.4. miR-210, miR-449a ja miR-34c ilmentymistasojen validoiminen reaaliaikaisen PCR:n avulla Urologian klinikan seeruminäytteet altistettiin RNA-eristämiselle Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kitin (Zymo Research) avulla. Uutettu miRNA käännetään käänteisesti cDNA:ksi miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kitin (ABMGood) avulla. cDNA:n laatu ja määrä arvioitiin spektrofotometrisesti BioSpec-nano instrumentilla (Shimadzu) ennen reaaliaikaista PCR:ää. miRNA-ilmentymisanalyysi suoritettiin Rotor Gene Q (Qiagen) instrumentilla. miR-210, miR-449a ja miR-34c tasot kvantifioitiin valmiiksi käyttövalmiilla alukkeilla ja BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix:llä (ABMGood).

2.5. Tilastollinen analyysi Tietojen normaalijakauma arvioitiin Shapiro-Wilk testillä, ja varianssin tasa-arvo arvioitiin Levenen testillä. Kuvailevat tilastot esitetään keskiarvoina ± SD:na parametrisille tiedoille ja mediaaneina (IQR) ja keskiarvoina (sijoitukset) ei-parametrisille tiedoille. Ryhmien vertailuihin käytettiin yksisuuntaista ANOVA:ta parametrisille tiedoille ja Kruskal-Wallis testiä ei-parametrisille tiedoille, jota seurasi Dunn-Bonferroni korjaus post hoc moninkertaisille vertailuille. Spearmanin järjestyskorrelaatiokerrointa käytettiin korrelaatioiden analysointiin. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p < 0,05.

miRNA-ilmentymä kvantifioitiin qRT-PCR:n avulla Ct (leikkauspiste) arvojen kautta ja normalisoitiin RNU6B_13:een. Suhteellisia miRNA-ilmentymistasoja verrattiin kaikkien ryhmien kesken 2-ΔCt menetelmällä ja laskettiin 2Ct (kohdegeeni) - Ct (viitegeeni). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin IBM SPSS v28:n (IBM Inc., Chicago, IL, USA) avulla.