miRNA가 정상적으로 하강하지 않은 고환과 수축성 고환을 구분하는 지표로 사용될 수 있을까요 (miRNA)

1. 서론 미하강 고환(UDT)은 가장 흔한 선천성 남성 기형으로, 만삭아의 1.0-4.6%, 조산아의 최대 45%에 영향을 미칩니다[1]. UDT는 선천적이거나 후천적일 수 있습니다. 선천성 사례에서 6개월 이후 자발적 하강은 드뭅니다[2]. 1세 이후 치료되지 않은 UDT는 간질 섬유화, 정자 형성 저하 및 불임 위험 증가를 초래합니다[3-5]. 더욱이, 치료되지 않은 UDT는 고환암(TC) 및 고환 비틀림(TT) 위험을 동반합니다. 이러한 합병증을 예방하기 위해서는 조기 진단과 치료가 중요합니다.

   진성 미하강 고환(UDT)과 수축성 고환(RT)을 구별하는 것은 임상적으로 어려운 과제입니다. 진성 UDT는 일관되게 음낭이 비어 있고, 고환이 결코 하강하지 않는 것을 특징으로 합니다. 반대로, RT는 자발적으로 하강하거나 수동으로 복원될 수 있지만, 다시 상승할 수 있습니다. RT 치료는 음낭 외부에 머무는 시간에 따라 달라집니다. UDT를 RT로 오진하면 치료가 지연되고 불가피한 합병증이 발생할 위험이 있습니다. 따라서 UDT와 RT를 구별할 수 있는 신뢰할 수 있는 지표가 중요합니다.

   마이크로RNA(miRNA)는 전사 후 유전자 발현을 조절하는 약 22개의 뉴클레오티드 비암호화 RNA입니다[6]. miRNA는 다양한 종에서 정자 형성(SP), 초기 배아 발달, 정자 기능 및 수정을 조절하는 것으로 알려져 있습니다[7]. 진성 UDT에서 예상되는 SP 장애를 고려할 때, UDT와 miRNA의 관계가 연구되어 왔습니다. 연구에 따르면 UDT에서 miRNA 수준이 변화합니다: miR-210은 상향조절되지만[8], miR-449a와 miR-34c는 하향조절됩니다[9-11]. 중요하게도, 수축성 고환(RT) 사례에서의 miRNA 변화에 대한 데이터는 현재 부족합니다. 이론적으로, RT에서는 SP가 방해받지 않을 것으로 예상됩니다. 따라서 SP 상태를 반영하는 miRNA 변화는 RT와 UDT를 구별하여 수술 대 추적 관찰 결정을 안내할 수 있습니다. 이 연구는 전향적으로 UDT, RT 및 정상 대조군 간의 miRNA 변화를 비교했습니다.

2. 재료 및 방법 2.1. 표본 크기 이 연구는 UDT, RT 및 정상 대조군 간의 miRNA 변화를 비교하기 위한 전향적 대조 시험으로 설계되었습니다. 표본 크기는 G*Power 3.1.9.6을 통해 결정되었습니다. 세 군을 비교한 miR-34c에 대한 일원 분산 분석(ANOVA) 검정력 분석은 이전 연구[10]의 효과 크기(f=1.2955357)를 사용했습니다. 99%의 검정력과 1%의 오류율을 달성하기 위해서는 총 24명의 표본 크기가 필요했습니다. 신뢰도를 높이기 위해, 연구는 최종적으로 30명의 환자를 등록하여 각 10명씩 세 군으로 나누었습니다.

2.2. 환자 군집 초기에, 비뇨기과 클리닉(2022년 3월부터 2023년 3월 사이)에서 미하강 고환(UDT)이 있는 10명의 소년, 수축성 고환(RT)이 있는 10명의 소년 및 10명의 건강한 자원봉사자(대조군)가 등록되었습니다. 그러나, 한 명의 RT 환자와 한 명의 대조군 환자는 혈액 채취에 대한 부모의 거부로 제외되었습니다. 촉지 가능한(일측성 또는 양측성) UDT 사례만 포함되었으며, 촉지 불가능한 유형은 제외되었습니다. 정확한 RT 진단을 보장하기 위해, 초기 의사 검사는 세 자세(누운 자세, 반누운 자세, 서 있는 자세)에서 수행되었으며, 이후 1개월간 부모 검사(하루 두 번)가 이어졌습니다. 고환이 음낭에 머무는 시간이 50%를 초과한 RT 환자만 포함되었습니다. 제외 기준에는 이전의 서혜부/음낭 수술, 결함이 있는 데이터 세트 또는 부적합한 혈청 샘플도 포함되었습니다.

2.3. 환자 데이터 및 대조군 샘플 수집 상세한 환자 병력, 신체 검사 및 일상 생화학 검사가 수행되었습니다. UDT 혈액 샘플은 오해를 방지하기 위해 수술 전에 채취되었습니다. 모든 군의 혈액은 5 mL 생화학 튜브에 채취되어 3000 rpm에서 10분간 원심분리되었습니다. 결과적으로 입자가 없는 혈청은 1.5 mL 튜브로 옮겨져 분석 시까지 -80°C에 보관되었습니다.

2.4. 실시간 PCR을 통한 miR-210, miR-449a 및 miR-34c 발현 수준 검증 비뇨기과 클리닉의 혈청 샘플은 Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit(Zymo Research)를 통해 RNA 분리 과정을 거쳤습니다. 추출된 miRNA는 miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit(ABMGood)를 통해 cDNA로 역전사되었습니다. cDNA의 품질과 양은 실시간 PCR 전에 BioSpec-nano 장비(Shimadzu)로 분광광도법을 통해 평가되었습니다. miRNA 발현 분석은 Rotor Gene Q(Qiagen) 장비를 통해 수행되었습니다. miR-210, miR-449a 및 miR-34c의 수준은 준비 완료 프라이머와 BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix(ABMGood)를 사용하여 정량화되었습니다.

2.5. 통계 분석 데이터의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 평가되었으며, 분산 동질성은 Levene 검정을 통해 평가되었습니다. 기술 통계는 모수적 데이터에 대해 평균 ± 표준편차로, 비모수적 데이터에 대해 중앙값(사분위 범위) 및 평균(순위)으로 제시됩니다. 군 비교를 위해, 모수적 데이터에는 일원 분산 분석(ANOVA)이 사용되었으며, 비모수적 데이터에는 Kruskal-Wallis 검정이 사용된 후 사후 다중 비교를 위해 Dunn-Bonferroni 보정이 적용되었습니다. 상관 관계 분석에는 Spearman 순위 상관 계수가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정되었습니다.

miRNA 발현은 Ct(교차점) 값을 통해 qRT-PCR로 정량화되었으며, RNU6B_13로 정규화되었습니다. 상대적 miRNA 발현 수준은 모든 군 간에 2-ΔCt 방법을 통해 비교되었으며, 2Ct(대상 유전자) - Ct(참조 유전자)로 계산되었습니다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS v28(IBM Inc., Chicago, IL, USA)을 통해 수행되었습니다.