Kunnen miRNA's worden gebruikt als markers voor het onderscheiden van niet-ingedaalde testikels van retractiele testikels (miRNA)

1. Introductie Niet-ingedaalde testikels (UDT's) zijn de meest voorkomende aangeboren mannelijke misvorming, die 1,0-4,6% van de voldragen zuigelingen en tot 45% van de premature zuigelingen treft [1]. UDT kan aangeboren of verworven zijn; spontane indaling bij aangeboren gevallen is zeldzaam na zes maanden [2]. Onbehandelde UDT na de leeftijd van één jaar leidt tot interstitiële fibrose, gedegenereerde spermatogenese en een verhoogd risico op onvruchtbaarheid [3-5]. Bovendien brengen onbehandelde UDT's risico's op testiskanker (TC) en verhoogde testiculaire torsie (TT) met zich mee. Vroege diagnose en behandeling zijn cruciaal om deze complicaties te voorkomen.

   Het onderscheiden van echte niet-ingedaalde testikels (UDT's) van retractiele testikels (RT's) is klinisch uitdagend. Echte UDT houdt een consistent lege scrotum in, waarbij de testikels nooit indalen. Daarentegen kunnen RT's spontaan indalen of handmatig worden gereduceerd, hoewel ze opnieuw kunnen opstijgen. Behandeling voor RT hangt af van de tijd die buiten het scrotum wordt doorgebracht. Het verkeerd diagnosticeren van UDT als RT brengt het risico op vertraagde behandeling en onvermijdelijke complicaties met zich mee. Daarom zijn betrouwbare indicatoren voor het onderscheiden van UDT's en RT cruciaal.

   MicroRNA's (miRNA's) zijn ~22-nucleotide niet-coderende RNA's die genexpressie posttranscriptioneel reguleren [6]. Van miRNA's is bekend dat ze spermatogenese (SP), vroege embryonale ontwikkeling, spermafunctie en bevruchting in verschillende soorten reguleren [7]. Gezien de verwachte SP-verstoring bij echte UDT's, is de UDT-miRNA-relatie onderzocht. Studies hebben veranderde miRNA-niveaus in UDT aangetoond: miR-210 is opgereguleerd [8], terwijl miR-449a en miR-34c zijn neergereguleerd [9-11]. Cruciaal is dat gegevens over miRNA-veranderingen bij retractiele testikel (RT) gevallen momenteel ontbreken. Theoretisch wordt niet verwacht dat de SP bij RT verstoord is. Dus kunnen miRNA-veranderingen, die de SP-status weerspiegelen, RT van UDT onderscheiden, wat chirurgische versus follow-up beslissingen kan sturen. Deze studie vergeleek miRNA-veranderingen prospectief over UDT-, RT- en normale controlegroepen.

2. Materialen en methoden 2.1. Steekproefomvang Deze studie is ontworpen als een prospectieve gecontroleerde trial om miRNA-veranderingen over UDT-, RT- en normale controlegroepen te vergelijken. De steekproefomvang werd bepaald via G*Power 3.1.9.6. Een one-way ANOVA poweranalyse voor miR-34c, die drie groepen vergeleek, gebruikte een effectgrootte (f=1,2955357) uit een eerdere studie [10]. Om 99% power en een 1% foutmarge te bereiken, was een totale steekproefomvang van 24 nodig. Om het vertrouwen te vergroten, werden uiteindelijk 30 patiënten ingeschreven, die werden verdeeld in drie groepen van 10.

2.2. Patiëntenpopulatie Aanvankelijk werden 10 jongens met niet-ingedaalde testikels (UDT's), 10 met retractiele testikels (RT's) en 10 gezonde vrijwilligers (controles) uit onze urologiekliniek (data tussen maart 2022 en maart 2023) ingeschreven. Echter, één RT-patiënt en één controlepatiënt werden uitgesloten vanwege ouderlijke weigering van bloedafname. Alleen palpabele (unilaterale of bilaterale) UDT-gevallen werden opgenomen, niet-palpabele typen werden uitgesloten. Om een nauwkeurige RT-diagnose te waarborgen, werden initiële artsenonderzoeken uitgevoerd in drie posities (rugligging, halfrugligging, staand), gevolgd door een 1-maandelijkse ouderlijke controle (tweemaal daags). Alleen RT-patiënten wier testikels >50% van de tijd in het scrotum doorbrachten, werden opgenomen. De uitsluitingscriteria omvatten ook eerdere lies-/scrotumchirurgie, defecte datasets of ongeschikte serummonsters.

2.3. Verzameling van patiëntengegevens en controlemonsters Gedetailleerde patiëntengeschiedenissen, lichamelijke onderzoeken en routine biochemische tests werden uitgevoerd. UDT-bloedmonsters werden vóór de operatie verzameld om misinterpretatie te voorkomen. Bloed van alle groepen werd verzameld in 5 mL biochemiebuizen en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 minuten. Het resulterende deeltjesvrije serum werd overgebracht naar 1,5 mL buisjes en opgeslagen bij -80°C tot analyse.

2.4. Validatie van de expressieniveaus van miR-210, miR-449a en miR-34c via real-time PCR Serummonsters van de urologiekliniek werden onderworpen aan RNA-isolatie via de Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Het geëxtraheerde miRNA werd omgekeerd getranscribeerd naar cDNA via de miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). cDNA-kwaliteit en -hoeveelheid werden spectrofotometrisch beoordeeld met een BioSpec-nano instrument (Shimadzu) vóór real-time PCR. miRNA-expressieanalyse werd uitgevoerd via een Rotor Gene Q (Qiagen) instrument. De niveaus van miR-210, miR-449a en miR-34c werden gekwantificeerd met kant-en-klare primers en BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Statistische analyse Datumnormaliteit werd beoordeeld via de Shapiro-Wilk test, en variantiegelijkheid werd beoordeeld via Levene's test. Beschrijvende statistieken worden gepresenteerd als de gemiddelden ± SD's voor parametrische data en medianen (IQR's) en gemiddelden (rangen) voor niet-parametrische data. Voor groepsvergelijkingen werd one-way ANOVA gebruikt voor parametrische data, en de Kruskal-Wallis test werd gebruikt voor niet-parametrische data, gevolgd door de Dunn-Bonferroni correctie voor post-hoc meervoudige vergelijkingen. Spearman's rangcorrelatiecoëfficiënt werd gebruikt om correlaties te analyseren. Statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05.

miRNA-expressie werd gekwantificeerd via qRT-PCR via Ct (kruispunt) waarden en genormaliseerd naar RNU6B_13. Relatieve miRNA-expressieniveaus werden vergeleken tussen alle groepen via de 2-ΔCt methode en berekend als 2Ct (doelgen) - Ct (referentiegen). Alle statistische analyses werden uitgevoerd via IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).