¿Podrían utilizarse los miRNAs como marcadores para distinguir testículos no descendidos de testículos retráctiles? (miRNA)

1. Introducción Los testículos no descendidos (TND) son la malformación congénita masculina más común, afectando al 1,0-4,6% de los bebés a término y hasta al 45% de los bebés prematuros [1]. El TND puede ser congénito o adquirido; el descenso espontáneo en los casos congénitos es raro después de los seis meses [2]. El TND no tratado más allá de un año de edad conduce a fibrosis intersticial, espermatogénesis degenerada y un mayor riesgo de infertilidad [3-5]. Además, los TND no tratados conllevan riesgos de cáncer testicular (CT) y torsión testicular (TT) aumentada. El diagnóstico y tratamiento tempranos son cruciales para prevenir estas complicaciones.

   Diferenciar los testículos verdaderamente no descendidos (TND) de los testículos retráctiles (TR) es clínicamente desafiante. El TND verdadero implica un escroto consistentemente vacío, con testículos que nunca descienden. Por el contrario, los TR pueden descender espontáneamente o ser reducidos manualmente, aunque pueden volver a ascender. El tratamiento para el TR depende del tiempo pasado fuera del escroto. Diagnosticar erróneamente un TND como TR conlleva el riesgo de un tratamiento retrasado y complicaciones inevitables. Por lo tanto, indicadores fiables para distinguir TND y TR son cruciales.

   Los microARNs (miARNs) son ARN no codificantes de ~22 nucleótidos que regulan la expresión génica postranscripcionalmente [6]. Se sabe que los miARNs regulan la espermatogénesis (SP), el desarrollo embrionario temprano, la función espermática y la fertilización en varias especies [7]. Dada la disrupción esperada de la SP en los TND verdaderos, se ha explorado la relación TND-miARN. Los estudios han mostrado niveles alterados de miARN en el TND: el miR-210 está regulado al alza [8], mientras que el miR-449a y el miR-34c están regulados a la baja [9-11]. Críticamente, actualmente faltan datos sobre los cambios de miARN en casos de testículo retráctil (TR). Teóricamente, no se espera que la SP esté alterada en el TR. Por lo tanto, las alteraciones de miARN, que reflejan el estado de la SP, podrían diferenciar el TR del TND, guiando las decisiones quirúrgicas versus las de seguimiento. Este estudio comparó prospectivamente los cambios de miARN entre grupos de TND, TR y controles normales.

2. Materiales y métodos 2.1. Tamaño de la muestra Este estudio está diseñado como un ensayo controlado prospectivo para comparar los cambios de miARN entre grupos de TND, TR y controles normales. El tamaño de la muestra se determinó mediante G*Power 3.1.9.6. Un análisis de potencia ANOVA unidireccional para el miR-34c, que comparó tres grupos, utilizó un tamaño del efecto (f=1,2955357) de un estudio previo [10]. Para alcanzar una potencia del 99% y una tasa de error del 1%, se necesitó un tamaño de muestra total de 24. Para aumentar la confianza, el estudio finalmente reclutó a 30 pacientes, que se dividieron en tres grupos de 10.

2.2. Población de pacientes Inicialmente, se reclutaron 10 niños con testículos no descendidos (TND), 10 con testículos retráctiles (TR) y 10 voluntarios sanos (controles) de nuestra clínica de urología (fechas entre marzo de 2022 y marzo de 2023). Sin embargo, se excluyó un paciente con TR y un paciente control debido al rechazo de los padres a la extracción de sangre. Solo se incluyeron casos de TND palpables (unilaterales o bilaterales), excluyendo los tipos no palpables. Para asegurar un diagnóstico preciso de TR, los exámenes médicos iniciales se realizaron en tres posiciones (supino, semisupino, de pie), seguidos de un examen paterno de 1 mes (dos veces al día). Solo se incluyeron pacientes con TR cuyos testículos pasaron >50% de su tiempo en el escroto. Los criterios de exclusión también incluyeron cirugía inguinal/escrotal previa, conjuntos de datos defectuosos o muestras de suero no adecuadas.

2.3. Recogida de datos de pacientes y muestras de control Se realizaron historiales detallados de los pacientes, exámenes físicos y pruebas bioquímicas rutinarias. Las muestras de sangre de TND se recogieron antes de la cirugía para evitar malinterpretaciones. La sangre de todos los grupos se recogió en tubos de bioquímica de 5 mL y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. El suero resultante libre de partículas se transfirió a tubos de 1,5 mL y se almacenó a -80°C hasta el análisis.

2.4. Validación de los niveles de expresión de miR-210, miR-449a y miR-34c mediante PCR en tiempo real Las muestras de suero de la clínica de urología se sometieron a aislamiento de ARN mediante el kit Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). El miARN extraído se transcribió inversamente en ADNc mediante el kit miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). La calidad y cantidad del ADNc se evaluaron espectrofotométricamente con un instrumento BioSpec-nano (Shimadzu) antes de la PCR en tiempo real. El análisis de expresión de miARN se realizó mediante un instrumento Rotor Gene Q (Qiagen). Los niveles de miR-210, miR-449a y miR-34c se cuantificaron con cebadores listos para usar y BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Análisis estadístico La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y la igualdad de varianzas se evaluó mediante la prueba de Levene. Las estadísticas descriptivas se presentan como las medias ± DE para datos paramétricos y medianas (RIC) y medias (rangos) para datos no paramétricos. Para las comparaciones entre grupos, se utilizó ANOVA unidireccional para datos paramétricos y la prueba de Kruskal-Wallis para datos no paramétricos, seguida de la corrección de Dunn-Bonferroni para comparaciones múltiples post hoc. Se utilizó el coeficiente de correlación de rangos de Spearman para analizar correlaciones. La significación estadística se estableció en p < 0,05.

La expresión de miARN se cuantificó mediante qRT-PCR a través de valores Ct (punto de cruce) y se normalizó a RNU6B_13. Los niveles de expresión relativa de miARN se compararon entre todos los grupos mediante el método 2-ΔCt y se calcularon como 2Ct (gen diana) - Ct (gen de referencia). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, EE. UU.).