Kan miRNAer brukes som markører for å skille mellom ikke-nedstegne testikler og retraktile testikler (miRNA)

1. Introduksjon Ikke-nedstegne testikler (UDT-er) er den vanligste medfødte mannlige misdannelsen, som rammer 1,0–4,6 % av fullgångne spedbarn og opptil 45 % av premature spedbarn [1]. UDT kan være medfødt eller ervervet; spontan nedstigning i medfødte tilfeller er sjelden etter seks måneder [2]. Ubehandlet UDT utover ett års alder fører til interstitiell fibrose, degenerert spermatogenese og økt risiko for infertilitet [3–5]. Dessuten bærer ubehandlede UDT-er risiko for testikkelkreft (TC) og forsterket testikkeltorsjon (TT). Tidlig diagnostisering og behandling er avgjørende for å forebygge disse komplikasjonene.

   Å skille ekte ikke-nedstegne testikler (UDT-er) fra retraktile testikler (RT-er) er klinisk utfordrende. Ekte UDT innebærer en konsekvent tom skrotum, der testiklene aldri stiger ned. Derimot kan RT-er spontant stige ned eller manuelt reduseres, selv om de kan stige opp igjen. Behandling for RT avhenger av tiden brukt utenfor skrotum. Feildiagnostisering av UDT som RT risikerer forsinket behandling og uunngåelige komplikasjoner. Derfor er pålitelige indikatorer for å skille UDT-er og RT avgjørende.

   MikroRNA (miRNA-er) er ~22-nukleotid ikke-kodende RNA som posttranskripsjonelt regulerer genuttrykk [6]. MiRNA-er er kjent for å regulere spermatogenese (SP), tidlig fosterutvikling, sædfunksjon og befruktning i ulike arter [7]. Gitt den forventede SP-forstyrrelsen i ekte UDT-er, har UDT-miRNA-forholdet blitt utforsket. Studier har vist endrede miRNA-nivåer i UDT: miR-210 er oppregulert [8], mens miR-449a og miR-34c er nedregulert [9–11]. Kritisk er det at data om miRNA-endringer i retraktile testikkel (RT) tilfeller for øyeblikket mangler. Teoretisk forventes ikke SP å være forstyrret ved RT. Derfor kan miRNA-endringer, som reflekterer SP-status, skille RT fra UDT, og veilede kirurgiske versus oppfølgingsbeslutninger. Denne studien sammenlignet miRNA-endringer på tvers av UDT-, RT- og normale kontrollgrupper prospektivt.

2. Materialer og metoder 2.1. Utvalgsstørrelse Denne studien er designet som en prospektiv kontrollert studie for å sammenligne miRNA-endringer på tvers av UDT-, RT- og normale kontrollgrupper. Utvalgsstørrelsen ble bestemt via G*Power 3.1.9.6. En enveis ANOVA styrkeanalyse for miR-34c, som sammenlignet tre grupper, benyttet en effektstørrelse (f=1,2955357) fra en tidligere studie [10]. For å oppnå 99 % styrke og en 1 % feilrate, var en total utvalgsstørrelse på 24 nødvendig. For å øke tilliten, inkluderte studien til slutt 30 pasienter, som ble delt inn i tre grupper på 10.

2.2. Pasientpopulasjon Opprinnelig ble 10 gutter med ikke-nedstegne testikler (UDT-er), 10 med retraktile testikler (RT-er) og 10 friske frivillige (kontroller) fra vår urologiklinikk (datoer mellom mars 2022 og mars 2023) inkludert. Imidlertid ble én RT-pasient og én kontrollpasient ekskludert på grunn av foreldrenes nektelse for blodprøvetaking. Kun palpable (ensidige eller dobbeltsidige) UDT-tilfeller ble inkludert, ikke-palpable typer ble ekskludert. For å sikre nøyaktig RT-diagnose ble innledende legeundersøkelser utført i tre posisjoner (ryggliggende, halvryggliggende, stående), etterfulgt av en 1-måneds foreldreundersøkelse (to ganger daglig). Kun RT-pasienter hvis testikler tilbrakte >50 % av tiden i skrotum ble inkludert. Eksklusjonskriteriene inkluderte også tidligere lyske-/skrotumkirurgi, mangelfulle datasett eller uegnede serumprøver.

2.3. Innsamling av pasientdata og kontrollprøver Detaljerte pasienthistorier, fysiske undersøkelser og rutinemessige biokjemiske tester ble utført. UDT-blodprøver ble samlet før kirurgi for å forhindre feiltolkning. Blod fra alle gruppene ble samlet i 5 mL biokjemi-rør og sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter. Det resulterende partikkelfrie serumet ble overført til 1,5 mL rør og lagret ved -80°C til analyse.

2.4. Validering av uttrykksnivåene til miR-210, miR-449a og miR-34c via real-time PCR Serumprøver fra urologiklinikken ble underlagt RNA-isolering via Quick-cfRNA™ Serum & Plasma Kit (Zymo Research). Den ekstraherte miRNA ble revers transkribert til cDNA via miRNA All-In-One cDNA Synthesis Kit (ABMGood). cDNA-kvalitet og -kvantitet ble vurdert spektrofotometrisk med et BioSpec-nano instrument (Shimadzu) før real-time PCR. miRNA-uttrykksanalyse ble utført via et Rotor Gene Q (Qiagen) instrument. Nivåene av miR-210, miR-449a og miR-34c ble kvantifisert med klar-til-bruk-primere og BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Statistisk analyse Datenormalitet ble vurdert via Shapiro-Wilk-testen, og varianslikhet ble vurdert via Levenes test. Beskrivende statistikk presenteres som gjennomsnitt ± SD for parametriske data og medianer (IQR-er) og gjennomsnitt (rangeringer) for ikke-parametriske data. For gruppesammenligninger ble enveis ANOVA brukt for parametriske data, og Kruskal-Wallis-testen ble brukt for ikke-parametriske data, etterfulgt av Dunn-Bonferroni-korreksjon for post hoc multiple sammenligninger. Spearmans rangkorrelasjonskoeffisient ble brukt til å analysere korrelasjoner. Statistisk signifikans ble satt til p < 0,05.

miRNA-uttrykk ble kvantifisert via qRT-PCR via Ct (krysspunkt)-verdier og normalisert til RNU6B_13. Relative miRNA-uttrykksnivåer ble sammenlignet blant alle grupper via 2-ΔCt-metoden og beregnet som 2Ct (målgen) - Ct (referansegen). Alle de statistiske analysene ble utført via IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).