Potrebbero i miRNA essere utilizzati come marcatori per distinguere i testicoli non discesi dai testicoli retrattili (miRNA)

1. Introduzione I testicoli non discesi (UDT) sono la malformazione congenita maschile più comune, che colpisce l'1,0-4,6% dei neonati a termine e fino al 45% dei neonati pretermine [1]. L'UDT può essere congenito o acquisito; la discesa spontanea nei casi congeniti è rara dopo sei mesi [2]. L'UDT non trattato oltre un anno di età porta a fibrosi interstiziale, spermatogenesi degenerata e aumento del rischio di infertilità [3-5]. Inoltre, gli UDT non trattati comportano rischi di cancro testicolare (TC) e maggiore torsione testicolare (TT). La diagnosi e il trattamento precoci sono cruciali per prevenire queste complicanze.

   Distinguere i veri testicoli non discesi (UDT) dai testicoli retrattili (RT) è clinicamente impegnativo. Il vero UDT coinvolge uno scroto costantemente vuoto, con testicoli che non discendono mai. Al contrario, i RT possono discendere spontaneamente o essere ridotti manualmente, sebbene possano risalire. Il trattamento per RT dipende dal tempo trascorso fuori dallo scroto. Diagnosticare erroneamente l'UDT come RT rischia un trattamento ritardato e complicazioni inevitabili. Pertanto, indicatori affidabili per distinguere UDT e RT sono cruciali.

   I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti di ~22 nucleotidi che regolano l'espressione genica post-trascrizionalmente [6]. È noto che i miRNA regolano la spermatogenesi (SP), lo sviluppo embrionale precoce, la funzione degli spermatozoi e la fecondazione in varie specie [7]. Data l'attesa interruzione della SP nei veri UDT, è stata esplorata la relazione UDT-miRNA. Studi hanno mostrato livelli alterati di miRNA negli UDT: miR-210 è sovraregolato [8], mentre miR-449a e miR-34c sono sotto-regolati [9-11]. Criticamente, i dati sui cambiamenti di miRNA nei casi di testicolo retrattile (RT) attualmente mancano. Teoricamente, non ci si aspetta che la SP sia interrotta nel RT. Pertanto, le alterazioni dei miRNA, che riflettono lo stato della SP, potrebbero differenziare RT da UDT, guidando le decisioni chirurgiche rispetto al follow-up. Questo studio ha confrontato prospetticamente i cambiamenti di miRNA tra gruppi UDT, RT e controllo normale.

2. Materiali e metodi 2.1. Dimensione del campione Questo studio è progettato come uno studio controllato prospettico per confrontare i cambiamenti di miRNA tra gruppi UDT, RT e controllo normale. La dimensione del campione è stata determinata tramite G*Power 3.1.9.6. Un'analisi di potenza ANOVA unidirezionale per miR-34c, che confrontava tre gruppi, ha utilizzato una dimensione dell'effetto (f=1,2955357) da uno studio precedente [10]. Per ottenere una potenza del 99% e un tasso di errore dell'1%, era necessaria una dimensione totale del campione di 24. Per aumentare la confidenza, lo studio ha infine arruolato 30 pazienti, divisi in tre gruppi di 10.

2.2. Popolazione di pazienti Inizialmente, sono stati arruolati 10 ragazzi con testicoli non discesi (UDT), 10 con testicoli retrattili (RT) e 10 volontari sani (controlli) dalla nostra clinica urologica (date tra marzo 2022 e marzo 2023). Tuttavia, un paziente RT e un paziente controllo sono stati esclusi a causa del rifiuto dei genitori al prelievo di sangue. Sono stati inclusi solo casi di UDT palpabili (unilaterali o bilaterali), escludendo i tipi non palpabili. Per garantire una diagnosi accurata di RT, gli esami medici iniziali sono stati eseguiti in tre posizioni (supina, semisupina, in piedi), seguiti da un esame genitoriale di 1 mese (due volte al giorno). Sono stati inclusi solo pazienti RT i cui testicoli hanno trascorso >50% del loro tempo nello scroto. I criteri di esclusione includevano anche precedente chirurgia inguinale/scrotale, set di dati difettosi o campioni di siero non idonei.

2.3. Raccolta dei dati dei pazienti e dei campioni di controllo Sono state eseguite anamnesi dettagliate dei pazienti, esami fisici e test biochimici di routine. I campioni di sangue UDT sono stati raccolti pre-operatoriamente per prevenire interpretazioni errate. Il sangue di tutti i gruppi è stato raccolto in provette da 5 mL per biochimica e centrifugato a 3000 rpm per 10 minuti. Il siero risultante privo di particelle è stato trasferito in provette da 1,5 mL e conservato a -80°C fino all'analisi.

2.4. Validazione dei livelli di espressione di miR-210, miR-449a e miR-34c tramite PCR in tempo reale I campioni di siero della clinica urologica sono stati sottoposti a isolamento dell'RNA tramite il Kit Quick-cfRNA™ Siero & Plasma (Zymo Research). Il miRNA estratto è stato retrotrascritto in cDNA tramite il Kit miRNA All-In-One cDNA Synthesis (ABMGood). La qualità e la quantità del cDNA sono state valutate spettrofotometricamente con uno strumento BioSpec-nano (Shimadzu) prima della PCR in tempo reale. L'analisi dell'espressione di miRNA è stata eseguita tramite uno strumento Rotor Gene Q (Qiagen). I livelli di miR-210, miR-449a e miR-34c sono stati quantificati con primer pronti all'uso e BlasTaq™ 2X qPCR MasterMix (ABMGood).

2.5. Analisi statistica La normalità dei dati è stata valutata tramite il test di Shapiro-Wilk, e l'uguaglianza delle varianze è stata valutata tramite il test di Levene. Le statistiche descrittive sono presentate come medie ± DS per dati parametrici e mediane (IQR) e medie (ranghi) per dati non parametrici. Per i confronti tra gruppi, è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale per dati parametrici e il test di Kruskal-Wallis per dati non parametrici, seguiti dalla correzione di Dunn-Bonferroni per confronti multipli post hoc. Il coefficiente di correlazione di rango di Spearman è stato utilizzato per analizzare le correlazioni. La significatività statistica è stata fissata a p < 0,05.

L'espressione di miRNA è stata quantificata tramite qRT-PCR tramite valori Ct (punto di incrocio) e normalizzata a RNU6B_13. I livelli di espressione relativa di miRNA sono stati confrontati tra tutti i gruppi tramite il metodo 2-ΔCt e calcolati come 2Ct (gene target) - Ct (gene di riferimento). Tutte le analisi statistiche sono state eseguite tramite IBM SPSS v28 (IBM Inc., Chicago, IL, USA).