フォン・ヴィレブランド病、後天性フォン・ヴィレブランド症候群の患者および健常被験者における内皮コロニー形成細胞 (ECFCs/2022)

本研究は、健常者由来の内皮コロニー形成細胞（ECFC）の参照集団を確立し、von Willebrand病（VWD）または後天性von Willebrand症候群（AVWS）患者由来のECFCと比較することを目的としています。

この比較により、VWFの質的・量的欠損の根底にある細胞的・分子的変化を同定するのに役立ちます。 得られた知見は、臨床的・生化学的データと相関させて解析され、疾患メカニズムの解明を目指します。

研究デザイン： 本試験は、Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinicoが主催し、SC Medicina - Emostasi e Trombosiが調整を行う、国内単施設非薬理試験です。

登録： 以前にVWDまたはAVWSと診断され、Angelo Bianchi Bonomi血友病・血栓症センターを紹介された患者を対象に、スケジュールされた登録のために連絡します。 過去の臨床的・生化学的・分子的データをレビューし、インフォームドコンセントを取得した後、研究専用の血液サンプルを採取し、VWFレベルを確認し、ECFCを分離します。

出血性疾患または血栓性疾患の既往のない健常ボランティアを、患者群と同数登録します。 簡単な健康面接とインフォームドコンセントの後、患者と同様の採血手順を受けます。

サンプル採取：

参加者は以下の手順のために採血を受けます：

• クエン酸ナトリウム入り8ミリリットルの血漿を分注し、-80℃で保存します。 これらのサンプルは、患者の診断確認、および対照群ではVWFレベルの測定に使用されます。
• 遺伝子解析： 以前に分子特性評価を受けていない先天性患者から、クエン酸採血管1本を採取します。
• ECFC分離のために、既発表プロトコルに従い、ヘパリンリチウム入り合計50ミリリットルの血液を採取します。 分離手順は、サンプル採取後3時間以内に行われます。 分離が成功しなかった場合、参加者は2回目かつ最終的な採血を依頼されることがあります。

全登録対象者共通の血漿サンプル検査： 全登録対象者は、標準的な血漿検査（VWF抗原、第VIII因子活性、VWF活性（VWF:RCoまたはVWF:GPIbR）、VWFコラーゲン結合活性、VWFプロペプチドを含む）を受けます。

低解像度VWFマルチマー解析は、施設内法または半自動システムのいずれかを用いて実施されます。

ECFCに対して実施される手順（全登録対象者共通）：

• ECFC分離は、Martin-Ramirezら（Nat Protoc. 2012;7:1709-1715）のプロトコルを改変したものを用いて行います。
• フローサイトメトリーを実施し、内皮系細胞であることを確認します。
• コンフォーカル免疫蛍光顕微鏡検査は、ラット尾コラーゲンタイプIでコーティングしたガラススライドにECFCを播種して実施します。 選択するマーカーには、核のDAPI、VWF、その他の内皮マーカーを含みます。
• 基礎的および刺激後（ヒスタミンまたはPMA曝露後）のVWF分泌は、施設内ELISAを用いて培養上清および細胞溶解物中のVWF:Agレベルを測定することで評価します。
• VWFマルチマー解析は、血漿サンプルに適用するものと同じ手順で実施します。
• RNA発現解析には、RNA分離、一本鎖cDNA合成、VWFおよび追加マーカーに対するプレデザインされたTaqMan®アッセイ（ThermoFisher Scientific）を用いた定量的リアルタイムPCR（GAPDHまたは他のハウスキーピング遺伝子で正規化）が含まれます。

グループB患者および選択された対照から分離されたECFCに限定して実施するアッセイ：

血管新生アッセイは、Matrigel（Corning）を用いて実施します。 健常ボランティア由来のECFCは、アッセイ条件の確立に使用され、患者から分離されたECFCの分析の参照として機能します。

グループCおよび選択された対照から分離されたECFCに限定して実施するアッセイ： サブグループ研究：

特定の遺伝子異常（2A型変異）に基づいて選択された患者において、低分子干渉RNA（siRNA）を用いた変異アレルの抑制を実施します。 この患者由来のECFCには、変異アレルを標的とするカスタマイズsiRNAを導入し、一方、市販のVWF特異的siRNAおよび陰性対照siRNAを、2A型ECFCおよび健常ボランティア由来ECFCの両方の対照として使用します。 全てのECFC手順は、siRNAサイレンシング後に繰り返し実施され、結果は健常対照ECFCから得られた結果と比較されます。

データ解析 連続変数は中央値および四分位範囲として報告され、カテゴリ変数はカウントおよびパーセンテージとして提示されます。 検査結果は平均値および標準偏差として表されます。 比較は、変数が正規分布または非正規分布に従うかどうかに応じて、一元配置分散分析またはクラスカル・ウォリス検定を用いて実施されます。 p値<0.05を統計的有意とみなします。

VWF mRNA発現レベルと、細胞培地中および細胞溶解物中に分泌されたVWF、ならびに対応する血漿VWFレベルとの間の相関分析は、適切にピアソンまたはスピアマンの順位相関を用いて実施されます。

利用可能な場合、各登録対象者から複数のECFCクローンを用いて解析を実施します。