Cellules endothéliales formant des colonies chez les patients atteints de VWD, AVWS et chez les sujets sains (ECFCs/2022)

L'étude vise à établir une population de référence de cellules progénitrices endothéliales formant des colonies (ECFC) à partir de sujets sains et à les comparer aux ECFC dérivées de patients atteints de VWD/AVWS.

Cette comparaison aidera à identifier les altérations cellulaires et moléculaires sous-jacentes aux défauts qualitatifs et quantitatifs du VWF. Les résultats seront corrélés avec les données cliniques et biochimiques pour clarifier les mécanismes de la maladie.

Conception de l'étude : Il s'agit d'une étude nationale, monocentrique, non pharmacologique, promue par la Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico et coordonnée par SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Recrutement : Les patients avec un diagnostic antérieur de VWD ou AVWS référés au Centre d'hémophilie et de thrombose Angelo Bianchi Bonomi seront contactés pour un recrutement programmé. Les données cliniques, biochimiques et moléculaires historiques seront examinées, le consentement éclairé obtenu, et un échantillon de sang spécifique à l'étude sera prélevé pour confirmer les niveaux de VWF et isoler les ECFC.

Des volontaires sains sans antécédents de troubles hémorragiques ou thrombotiques seront recrutés en nombre égal à celui du groupe de patients. Après un bref entretien de santé et un consentement éclairé, ils subiront les mêmes procédures de prélèvement sanguin que les patients.

Collecte d'échantillons :

Les participants subiront un prélèvement sanguin pour les procédures suivantes :

• Huit millilitres de plasma en citrate de sodium seront aliquetés et stockés à -80 °C. Ces échantillons seront utilisés pour confirmer les diagnostics des patients et, pour les témoins, pour mesurer les niveaux de VWF.
• Analyse génétique : un tube de citrate sera prélevé pour les patients congénitaux sans caractérisation moléculaire préalable.
• Un total de 50 ml de sang en héparine de lithium sera prélevé pour l'isolement des ECFC suivant le protocole précédemment publié. La procédure d'isolement sera réalisée dans les 3 heures suivant la collecte de l'échantillon. En cas d'isolement infructueux, les participants pourront être invités à subir un deuxième et dernier prélèvement sanguin.

Tests des échantillons de plasma communs à tous les sujets recrutés : tous les sujets recrutés subiront des tests plasmatiques standard, incluant l'antigène VWF, l'activité FVIII, l'activité VWF (VWF:RCo ou VWF:GPIbR), l'activité de liaison au collagène du VWF et le propeptide VWF.

L'analyse des multimères de VWF à basse résolution sera réalisée soit par la méthode interne, soit par le système semi-automatisé.

Procédure à réaliser sur les ECFC (commune à tous les sujets recrutés) :

• L'isolement des ECFC suivra une version modifiée du protocole de Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• La cytométrie en flux sera réalisée pour confirmer la lignée endothéliale.
• La microscopie par immunofluorescence confocale sera réalisée en plaçant les ECFC sur des lames de verre recouvertes de collagène de type I de queue de rat. Les marqueurs sélectionnés incluront le DAPI pour les noyaux, le VWF et d'autres marqueurs endothéliaux.
• La sécrétion basale et stimulée de VWF (après exposition à l'histamine ou au PMA) sera évaluée en mesurant les niveaux de VWF:Ag dans les milieux de culture et les lysats cellulaires en utilisant un ELISA interne.
• L'analyse des multimères de VWF sera réalisée en utilisant la même procédure appliquée aux échantillons de plasma.
• L'analyse de l'expression de l'ARN inclura l'isolement de l'ARN, la synthèse d'ADNc de premier brin et la PCR quantitative en temps réel pour le VWF et d'autres marqueurs en utilisant des tests TaqMan® prédéfinis (ThermoFisher Scientific), normalisés par rapport au GAPDH ou à d'autres gènes de ménage.

Test limité aux ECFC isolées des patients du groupe B et des témoins sélectionnés :

Le test d'angiogenèse sera réalisé en utilisant du Matrigel (Corning). Les ECFC obtenues à partir de volontaires sains seront utilisées pour établir les conditions du test et serviront de référence pour l'analyse des ECFC isolées des patients.

Test limité aux ECFC isolées des patients du groupe C et des témoins sélectionnés : sous-étude :

L'inhibition de l'allèle mutant en utilisant un petit ARN interférent (siRNA) sera réalisée chez un patient sélectionné sur la base du défaut génétique spécifique (mutation de type 2A). Les ECFC de ce patient seront transfectées avec un siRNA personnalisé ciblant l'allèle mutant, tandis qu'un siRNA commercial spécifique au VWF et un siRNA de contrôle négatif seront utilisés comme témoins sur les ECFC de type 2A et les ECFC dérivées de volontaires sains. Toutes les procédures sur les ECFC seront répétées après le silence induit par siRNA, et les résultats seront comparés à ceux obtenus à partir des ECFC témoins sains.

Analyse des données : Les variables continues seront rapportées comme médiane et intervalle interquartile, tandis que les variables catégorielles seront présentées comme effectifs et pourcentages. Les résultats de laboratoire seront exprimés comme moyenne et écart-type. Les comparaisons seront réalisées en utilisant des tests ANOVA à un facteur ou de Kruskal-Wallis, selon que les variables suivent une distribution normale ou non normale. Une valeur p <0,05 sera considérée comme statistiquement significative.

Les analyses de corrélation entre les niveaux d'expression de l'ARNm du VWF et le VWF sécrété dans les milieux cellulaires, les lysats cellulaires et les niveaux plasmatiques correspondants de VWF seront menées en utilisant la corrélation de Pearson ou le rang de Spearman, selon le cas.

Lorsque disponibles, les analyses seront réalisées en utilisant plus d'un clone d'ECFC provenant de chaque sujet recruté.