Endotheliale Kolonie-Vormende Cellen bij Patiënten met VWD, AVWS en Gezonde Proefpersonen (ECFCs/2022)

De studie heeft als doel een referentiepopulatie van endotheliale kolonievormende cellen (ECFC's) van gezonde proefpersonen vast te stellen en deze te vergelijken met ECFC's afkomstig van patiënten met VWD/AVWS.

Deze vergelijking zal helpen bij het identificeren van cellulaire en moleculaire veranderingen die ten grondslag liggen aan kwalitatieve en kwantitatieve VWF-defecten. Bevindingen zullen worden gecorreleerd met klinische en biochemische gegevens om ziekte-mechanismen op te helderen.

Studieopzet: Dit is een nationale, monocentrische, niet-farmacologische studie gepromoot door Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico en gecoördineerd door SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Inschrijving: Patiënten met een eerdere diagnose van VWD of AVWS die verwezen zijn naar het Angelo Bianchi Bonomi Hemofilie- en Trombosecentrum zullen worden benaderd voor geplande inschrijving. Historische klinische, biochemische en moleculaire gegevens zullen worden beoordeeld, geïnformeerde toestemming zal worden verkregen en een studie-specifiek bloedmonster zal worden afgenomen om VWF-niveaus te bevestigen en ECFC's te isoleren.

Gezonde vrijwilligers zonder voorgeschiedenis van bloedingen of trombose-aandoeningen zullen worden ingeschreven in een aantal gelijk aan dat van de patiëntengroep. Na een kort gezondheidsinterview en geïnformeerde toestemming zullen zij dezelfde bloedafnameprocedures ondergaan als patiënten.

Monsterafname:

Deelnemers zullen bloedafname ondergaan voor de volgende procedures:

• Acht milliliter plasma in natriumcitraat zal worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -80 °C. Deze monsters zullen worden gebruikt om de diagnoses van patiënten te bevestigen en, voor controles, om VWF-niveaus te meten.
• Genetische analyse: één citraatbuis zal worden afgenomen voor aangeboren patiënten zonder eerdere moleculaire karakterisering.
• In totaal zal 50 ml bloed in lithiumheparine worden afgenomen voor ECFC-isolatie volgens het eerder gepubliceerde protocol. De isolatieprocedure zal worden uitgevoerd binnen 3 uur na monstername. In geval van niet-succesvolle isolatie kan deelnemers worden gevraagd om een tweede en laatste bloedafname te ondergaan.

Plasmatest die gemeenschappelijk is voor alle ingeschreven proefpersonen: alle ingeschreven proefpersonen zullen standaard plasmatesten ondergaan, inclusief VWF-antigeen, FVIII-activiteit, VWF-activiteit (VWF:RCo of VWF:GPIbR), VWF-collageenbindende activiteit en VWF-propeptide.

Laag-resolutie VWF-multimeeranalyse zal worden uitgevoerd met behulp van de interne methode of het semi-geautomatiseerde systeem.

Procedure die zal worden uitgevoerd op ECFC's (gemeenschappelijk voor alle ingeschreven proefpersonen):

• ECFC-isolatie zal een aangepaste versie volgen van het protocol van Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Flowcytometrie zal worden uitgevoerd om de endotheliale afstamming te bevestigen.
• Confocale immunofluorescentiemicroscopie zal worden uitgevoerd door ECFC's te plateren op rattenstaartcollageen type I-gecoate glasplaatjes. Geselecteerde markers zullen DAPI voor kernen, VWF en andere endotheliale markers omvatten.
• Basale en gestimuleerde VWF-secretie (na blootstelling aan histamine of PMA) zal worden beoordeeld door VWF:Ag-niveaus in kweekmedia en cellysaten te meten met behulp van een interne ELISA.
• VWF-multimeeranalyse zal worden uitgevoerd met dezelfde procedure die wordt toegepast op plasmasamples.
• RNA-expressieanalyse zal RNA-isolatie, first-strand cDNA-synthese en kwantitatieve real-time PCR voor VWF en aanvullende markers omvatten met behulp van vooraf ontworpen TaqMan® assays (ThermoFisher Scientific), genormaliseerd naar GAPDH of andere huishoudgenen.

Assay beperkt tot ECFC's geïsoleerd van groep B-patiënten en geselecteerde controles:

Angiogenese-assay zal worden uitgevoerd met behulp van Matrigel (Corning). ECFC's verkregen van gezonde vrijwilligers zullen worden gebruikt om de assay-condities vast te stellen en zullen dienen als referentie voor de analyse van ECFC's geïsoleerd van patiënten.

Assay beperkt tot ECFC's geïsoleerd van groep C en geselecteerde controles: subgroepstudie:

Remming van het mutante allel met behulp van small interfering RNA (siRNA) zal worden uitgevoerd bij een patiënt geselecteerd op basis van het specifieke genetische defect (type 2A-mutatie). ECFC's van deze patiënt zullen worden getransfecteerd met een op maat gemaakte siRNA gericht op het mutante allel, terwijl een commerciële VWF-specifieke siRNA en een negatieve controle-siRNA zullen worden gebruikt als controles op zowel type 2A-ECFC's als ECFC's afkomstig van gezonde vrijwilligers. Alle ECFC-procedures zullen worden herhaald na siRNA-silencing en resultaten zullen worden vergeleken met die verkregen van gezonde controle-ECFC's.

Data-analyse Continue variabelen zullen worden gerapporteerd als mediaan en interkwartielbereik, terwijl categorische variabelen zullen worden gepresenteerd als aantallen en percentages. Laboratoriumresultaten zullen worden uitgedrukt als gemiddelde en standaarddeviatie. Vergelijkingen zullen worden uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA of Kruskal-Wallis-tests, afhankelijk van of variabelen een normale of niet-normale verdeling volgen. Een p-waarde <0,05 zal als statistisch significant worden beschouwd.

Correlatieanalyses tussen VWF mRNA-expressieniveaus en VWF uitgescheiden in celmedia, cellysaten en corresponderende plasma VWF-niveaus zullen worden uitgevoerd met behulp van Pearson's of Spearman's rangcorrelatie, naar gelang van toepassing.

Indien beschikbaar, zullen analyses worden uitgevoerd met meer dan één ECFC-kloon van elke ingeschreven proefpersoon.