Endothelkolonie-bildende Zellen bei Patienten mit VWD, AVWS und gesunden Probanden (ECFCs/2022)

Die Studie zielt darauf ab, eine Referenzpopulation von endothelialen koloniebildenden Zellen (ECFCs) von gesunden Probanden zu etablieren und diese mit ECFCs von Patienten mit VWD/AVWS zu vergleichen.

Dieser Vergleich wird helfen, zelluläre und molekulare Veränderungen zu identifizieren, die qualitativen und quantitativen VWF-Defekten zugrunde liegen. Die Ergebnisse werden mit klinischen und biochemischen Daten korreliert, um Krankheitsmechanismen zu klären.

Studiendesign: Dies ist eine nationale, monozentrische, nicht-pharmakologische Studie, die von der Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico gefördert und von der SC Medicina - Emostasi e Trombosi koordiniert wird.

Einschluss: Patienten mit einer früheren Diagnose von VWD oder AVWS, die an das Angelo Bianchi Bonomi Hämophilie- und Thrombosezentrum überwiesen wurden, werden für eine geplante Einschreibung kontaktiert. Historische klinische, biochemische und molekulare Daten werden überprüft, eine Einwilligungserklärung eingeholt und eine studienspezifische Blutprobe entnommen, um VWF-Spiegel zu bestätigen und ECFCs zu isolieren.

Gesunde Freiwillige ohne Vorgeschichte von Blutungs- oder Thromboseerkrankungen werden in einer Anzahl eingeschlossen, die der Patientengruppe entspricht. Nach einem kurzen Gesundheitsinterview und Einwilligungserklärung unterziehen sie sich denselben Blutentnahmeverfahren wie Patienten.

Probenentnahme:

Teilnehmer werden einer Blutentnahme für folgende Verfahren unterzogen:

• Acht Milliliter Plasma in Natriumcitrat werden aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Diese Proben werden verwendet, um die Diagnosen der Patienten zu bestätigen und bei Kontrollen, um VWF-Spiegel zu messen.
• Genetische Analyse: Eine Citratröhre wird für angeborene Patienten ohne vorherige molekulare Charakterisierung gesammelt.
• Insgesamt 50 ml Blut in Lithiumheparin werden zur ECFC-Isolierung gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll entnommen. Das Isolierungsverfahren wird innerhalb von 3 Stunden nach Probenentnahme durchgeführt. Bei erfolgloser Isolierung können Teilnehmer gebeten werden, eine zweite und letzte Blutentnahme durchzuführen.

Plasmaproben-Tests für alle eingeschlossenen Probanden: Alle eingeschlossenen Probanden werden standardmäßige Plasmatests durchlaufen, einschließlich VWF-Antigen, FVIII-Aktivität, VWF-Aktivität (VWF:RCo oder VWF:GPIbR), VWF-Kollagenbindungsaktivität und VWF-Propeptid.

Eine niedrigauflösende VWF-Multimeranalyse wird entweder mit der hauseigenen Methode oder einem halbautomatisierten System durchgeführt.

Verfahren, die an ECFCs durchgeführt werden (für alle eingeschlossenen Probanden):

• ECFC-Isolierung folgt einer modifizierten Version des Protokolls von Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Durchflusszytometrie wird durchgeführt, um die endotheliale Abstammung zu bestätigen.
• Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie wird durchgeführt, indem ECFCs auf Ratten-Schwanz-Kollagen Typ I-beschichteten Glasobjektträgern platziert werden. Ausgewählte Marker umfassen DAPI für Kerne, VWF und andere endotheliale Marker.
• Basale und stimulierte VWF-Sekretion (nach Histamin- oder PMA-Exposition) wird durch Messung von VWF:Ag-Spiegeln in Kulturmedien und Zelllysaten mit einem hauseigenen ELISA bewertet.
• VWF-Multimeranalyse wird mit demselben Verfahren durchgeführt, das auf Plasmaproben angewendet wird.
• RNA-Expressionsanalyse umfasst RNA-Isolierung, First-Strand-cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR für VWF und zusätzliche Marker mit vorgefertigten TaqMan®-Assays (ThermoFisher Scientific), normalisiert auf GAPDH oder andere Haushaltsgene.

Assay beschränkt auf ECFCs, die von Gruppe-B-Patienten und ausgewählten Kontrollen isoliert wurden:

Ein Angiogenese-Assay wird mit Matrigel (Corning) durchgeführt. ECFCs von gesunden Freiwilligen werden verwendet, um die Assay-Bedingungen festzulegen und dienen als Referenz für die Analyse von ECFCs, die von Patienten isoliert wurden.

Assay beschränkt auf ECFCs, die von Gruppe C und ausgewählten Kontrollen isoliert wurden: Untergruppenstudie:

Die Hemmung des mutierten Allels mit small interfering RNA (siRNA) wird bei einem Patienten durchgeführt, der basierend auf dem spezifischen genetischen Defekt (Typ-2A-Mutation) ausgewählt wurde. ECFCs von diesem Patienten werden mit einer maßgeschneiderten siRNA transfiziert, die das mutierte Allel zielt, während eine kommerzielle VWF-spezifische siRNA und eine negative Kontroll-siRNA als Kontrollen sowohl auf Typ-2A-ECFCs als auch auf ECFCs von gesunden Freiwilligen verwendet werden. Alle ECFC-Verfahren werden nach siRNA-Stilllegung wiederholt, und die Ergebnisse werden mit denen von gesunden Kontroll-ECFCs verglichen.

Datenanalyse: Kontinuierliche Variablen werden als Median und Interquartilsbereich berichtet, während kategoriale Variablen als Anzahl und Prozentsatz dargestellt werden. Laborergebnisse werden als Mittelwert und Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche werden mit Einweg-ANOVA oder Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt, je nachdem, ob Variablen einer normalen oder nicht-normalen Verteilung folgen. Ein p-Wert <0,05 wird als statistisch signifikant betrachtet.

Korrelationsanalysen zwischen VWF-mRNA-Expressionsspiegeln und VWF, der in Zellmedien, Zelllysaten und entsprechenden Plasma-VWF-Spiegeln ausgeschieden wird, werden mit Pearson- oder Spearman-Rangkorrelation durchgeführt, wie angemessen.

Wenn verfügbar, werden Analysen mit mehr als einem ECFC-Klon von jedem eingeschlossenen Probanden durchgeführt.